荧光分析法实验版.pptVIP

荧光分析法具有灵敏度高，比分光光度法高103~104倍。线性范围宽，方法简便快速且选择性较好等多优点。 近20年来，各式各样新型荧光分析仪不断问世，荧光分析法发展迅速，应用面日益拓宽，尤其是在生物试样的分析及生命科学研究方面（如DNA序列分析等）展现出广阔的前景。 一、荧光的产生 物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级和转动能级。 分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快，大约10-15 s），成为激发单重态分子。激发态分子不稳定，可以通过以下几种途径释放能量返回基态。 1. 振动驰豫 2. 内转换 3. 荧光 4. 系间窜跃 5. 磷光 （一）荧光的检测 （二）激发光谱与荧光光谱的形成 任何荧光物质，都具有两种特征光谱，即激发光谱(excitation spectrum)和荧光发射光谱(fluorescence emission spectrum)。 三、影响荧光产生及荧光强度的因素 （一）物质产生荧光的必要条件 第二节 定性定量分析 一、荧光强度与溶液浓度的关系 第三节 仪器 一、仪器的构造及原理 第五节 荧光分析法的应用 （一） 有机物的荧光分析 （二） 无机元素的荧光分析 （三）在生命科学中的应用  荧光分析测定邻、间-羟基苯甲酸混合物中的二组分析含量 一，目标要求 1.学习荧光分析法的基本理论和操作; 2.用荧光分析法进行多组分含量的测定。 二，原理 某些具有∏-∏电子共轭体系的分子易吸收某一波段的紫外光而被激发，如该物质具有较高的荧光效率，则会以荧光的形式释放出吸收的一部分能量而回到基态。建立在发生荧光现象基础上的分析方法，称为荧光分析法，而常把被测物称为荧光物质。在稀溶液中，荧光强度It与入射光的强度Io、荧光量子效率ψf 以及荧光物质的浓度c等有关，可表示为If=KψfIoεbc。 式中K为比例常数，与仪器性能有关，ε为摩尔吸光系数，b为液层厚度。由此可见，当仪器的参数固定后，以最大激发波长的光为入射光，测定最大发射波长光的强度时，荧光强度 If与荧光物质的浓度c成正比。 在中性水溶液中，邻-羟基苯甲酸（水杨酸）生成分子内氢键（ ）增加分子的刚性而有较强荧光，而间-羟基苯甲酸则无荧光。在PH的碱性溶液中，二者在310nm附近的紫外光照射下则均会发生荧光，且邻-羟基苯甲酸的荧光强度与其在PH5.5时相同。因此，在PH5.5时可测定水杨酸的含量，间-羟基苯甲酸不干扰。另取同量试样溶液调PH到12，从测得的荧光强度中扣除水杨酸产生的荧光即可求出间-羟基苯甲酸的含量。在0~12ug/ml范围内荧光强度与二组分浓度均呈线性关系。对-羟基苯甲酸在此条件下无荧光，因而不干扰测定。 PH12 间-羟基苯甲酸溶液的光谱示图 * * 荧光分析法第一节 概 述 当紫外线照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失，这种光线被称为荧光(fluorescence)。 由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光的波长和发射光的波长也不同，利用这个特性可以进行物质的定性鉴别。如果该物质的浓度不同，它所发射的荧光强度就不同，测量物质的荧光强度可对其进行定量测定。 荧光分析法（fluorescence analysis）就是利用物质的荧光特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。 第一节 基本原理 光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不同波长的激发光，照射到样品溶液上，激发样品产生荧光。样品发出的荧光为宽带光谱，需通过发射单色器分光后再进入检测器，检测不同发射波长下的荧光强度F。由于激发光不可能完全被吸收，可透过溶液，为了防止透射光对荧光测定的干扰，常在与激发光垂直的方向检测荧光（因荧光是向各个方向发射的）。 1. 激发光谱 保持荧光发射波长不变（即固定发射单色器），依次改变激发光波长（即调节激发单色器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F（即激发光波长扫描）。然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。 激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。物质的激发光谱与它的吸收光谱相似，所不同的是纵坐标。 2. 荧光光谱 荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波长不变（即固定激发单色器），依次改变荧光发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光强度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，得到荧光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大