蛋白质多肽链氨基酸序列的测定.ppt

蛋白质一级结构（primary structure）的测定 蛋白质测序的发展简史 自从1953 年Sanger首次完成胰岛素的氨基酸顺序测定以来，目前已有很大改进。但是Sanger花费多年时间才基本搞清胰岛素的一级结构，现在由于方法改进及自动化分析仪器的产生，现在已有数百种蛋白质的氨基酸序列问世。 氨基酸序列测定的基本步骤（化学方法） 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端和羧基末端 为何种氨基酸 把肽链水解成片段 测定各肽段的氨基酸排列顺序 综合运用多种水解法分析肽段中的氨基酸顺序 测序前的准备工作 要求： 样品纯度：97%以上 相对分子质量：允许误差在10%左右 （一）多肽链的拆分 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍或高浓度的盐处理，即可使寡聚蛋白质中的亚基。 如果多肽链间通过共价键（S—S）连接在一起，可采用氧化剂或还原剂将其断裂。 （二）测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。 （三）二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防它重新被氧化。 一、氨基酸组成 蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定它们的量，算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或个数。 二、末端测定的具体方法 化学法 二硝基氟苯法（DNP法） 二甲基氨基萘磺酰氯法 （Dansyl-氯法） 肼解法 还原成氨基醇法 酶解法 亮氨酸氨肽酶法 细胞外氨肽酶法 羧肽酶A法 羧肽酶B法 羧肽酶C法 二硝基氟苯法(Sanger法） 2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成黄色二硝基苯衍生物（DNP-氨基酸） 氨基肽酶法 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个地向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-端残疾顺序 C-末端之肼解法 多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 肼解过程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破坏而不易测出，C-末端的精氨酸转变为鸟氨酸 羧肽酶法 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个地水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-端残疾顺序 羧肽酶 来源 专一性 CpA 胰脏 能释放除Pro、Arg、Lys外的所有的C-端氨基酸 CpB 胰脏 主要水解C-端为Arg、Lys的肽键 CpC 植物或微生物 相当广泛，几乎能释放C-端的所有氨基酸 还原成氨基醇法 多肽C-端氨基酸可被硼氢化锂（LiBH4）还原成α-氨基醇，用层析法可以鉴定氨基酸种类。 Sanger早期测定胰岛素C-末端氨基酸采用此法。 三、水解肽链成肽段 水解酶或化学试剂 水解部位 作用的氨基酸 胰蛋白酶 羧基侧 赖氨酸、精氨酸 胰凝乳蛋白酶 羧基侧 芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸） 溴化氰 羧基侧 甲硫氨酸 水解后得到的肽段，可用离子层析或其他层析方法将其分离纯化。比如用双向电泳可以得到肽图，由此可知肽段的多少。 四、 Edman降解法测定肽段的氨基酸序列 耦联： 使用苯异硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理，PITC与肽链的N-端的氨基酸残基反应，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。 水解： PTC-肽用三氟乙酸处理，N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。　　 萃取： 将该衍生物用有机溶剂（例如氯丁烷）从反应液中萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在溶液中。 转化： 萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。 Edman降解法测序每次只能测定几十个氨基酸残基，所以要测定较大蛋白质的氨基酸序列，需要将其降解为一些肽段，经HPLC分离出各个肽段，然后再进行Edman降解测序。 五、鉴定每个肽段氨基酸顺序 ABCDE *ABCDE 部分水解 *A,*AB,*ABC,*A