现代分子生物学创新技术基础第五章.ppt

4 ）通过胚胎干细胞转染制备转基因鼠 小鼠胚胎干（ES）细胞来自于交配后3.5-4.5天的胚胎，并产生于囊胚的内细胞团。 ES细胞可在体外培养并很容易转染。 转染方法：电击法、逆转录病毒载体法、脂质体包 装法等将目的基因的表达载体转染ES细胞。 转染后的ES细胞注射到一个宿主囊胚中，并将其再 植入假孕母鼠体内，该胚胎将发育成嵌合体。其生 殖系可能整合了外源基因，经适当交配可获得纯合 转基因小鼠． 5） 体细胞核移植技术 将体细胞核植入去核的卵细胞中，体细胞核被卵细胞重新程序化，无论供体细胞的分化状态如何，使其能够重新演绎发育的整个过程。 通常所说的动物克隆指体细胞克隆，即动物的无性繁殖。 英国科学家Wilmut等于1997年首次报道应用体细胞核移植技术生产出遐迩闻名的多利羊 若供体细胞核是经过转染而添加了转基因，将其移植到去核卵后发育而成的动物就将是转基因动物。 第一次证实这种设想的是Schnieke et al. 他用人的凝血因子IX基因转染培养的羊成纤维细胞，生产一个克隆的转基因羊，叫Polly,在它的乳汁中产出了重组蛋白IX 因子。 1 基因组整体水平的DNA甲基化检测： 将DNA降解为单核苷酸后采用诸如液相色谱或质谱等仪器区分甲基化与非甲基化的胞嘧啶。 2 MSRE（ methylation sensitive restriction endonuclease）法： 基本原理： 对于甲基化敏感Ⅱ型限制性内切酶而言，若其识别序列中含有一个或多个甲基化位点，则不能切割该序列。 用甲基敏感Ⅱ型内切酶切割含有一个或多个CpG序列的片段，然后用DNA印迹法区分甲基化与非甲基化的相关序列。 优点：可直接评价CpG岛甲基化状态，获得一些对被检基因甲基化的定量分析信息。 不足： DNA质、量要求均较高。仅能提供MSRE识别序列中那些CpG岛甲基化状态的信息。 3 亚硫酸氢盐处理DNA后的相关检测方法： 基本原理：所有未甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢盐修饰后成为硫化胞嘧啶,经脱盐、脱磺化基团最后变成尿嘧啶,在PCR扩增过程中被胸腺嘧啶替代；而对于已甲基化的胞嘧啶则无此作用,因而保持不变。 非甲基化 DNA: 修饰前：AGG CGTTCTAG CGAAGC 修饰后：AGG UGTTUTAG UGAAGU 甲基化 DNA : 修饰前：AGGmCGTTCTAGmCGAAGC 修饰后：AGG CGTTUTAG CGAAGU 1）甲基化特异性PCR 在PCR反应时,设计两套不同的引物对:其中一套引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化DNA链设计,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点发生了甲基化; 另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA 链设计,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点没有甲基化。 优点: 敏感性、特异性高,操作简便。 不足： 以引物中所有CpG位点的胞嘧啶完全甲基化为前提设计,而事实上甲基化的CpG岛中并非每个位点都完全甲基化,将对检测结果造成一定影响。此外,选择和设计引物的不慎,将会导致假阳性的发生。 2）DGGE 亚硫酸氢钠处理DNA后，未甲基化的胞嘧啶最后变成尿嘧啶，已甲基化的胞嘧啶保持不变，经PCR后产物在DGGE中的电泳行为不同，可以区分有无甲基化。 3) SSCP 亚硫酸氢钠处理DNA后，未甲基化的胞嘧啶最后变成尿嘧啶，已甲基化的胞嘧啶保持不变,单链构象不同，可以用SSCP检测。 4）测序分析DNA甲基化 亚硫酸氢钠处理DNA后经PCR扩增，进行测序。 PCR引物中不能包括甲基化位点，甲基化位点应位于两引物之间。 5）甲基化特异性寡聚核苷酸生物芯片 亚硫酸氢钠处理DNA后，未甲基化的胞嘧啶最后变成尿嘧啶，已甲基化的胞嘧啶保持不变，在固体支持物上固定与甲基化和未甲基化等位基因对应的寡核苷酸为探针，将亚硫酸氢钠处理后的DNA扩增的产物作为杂交目标。可以同时检测多个基因多个CpG位点的甲基化状况。 （二） RNA干扰 RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种由双链RNA（double –stranded RNA,dsRNA）始动的序列特异性基因沉默机制。 1 RNAi介导转录后基因沉默的分子机制: ①启动阶段: 内源或外源的dsRNA 分子在细胞内被Dicer 核酸酶或其同源物剪切成21～23nt 的siRNA ,3′端带有2个碱基突出的黏性末端 . ②效应阶段: RNAi 特异性的各种酶和其它一些因子与siRNA 结合成RNA诱导沉默复合体—RISC(RNA-inducing silence