电镜样品制备与观察.pptVIP

主要内容 样品的取材与固定 样品的渗透与包埋 修快与支持膜的制备 玻璃刀的制作与超薄切片 电子染色 电子显微镜的使用与生物样品超微结构观察 一、样品的取材与固定 （一）实验目的 1 掌握电镜样品取材的方法与要求 2 掌握电镜样品的固定方法与要求 （二）实验原理 （见原理部分） （三）实验材料 小白鼠肝脏（等） （四）实验方法 1 动物麻醉 将小白鼠放入烧杯，放入一蘸有氯仿的脱脂棉球，用培养皿盖住烧杯口，约3～5min后小白鼠被麻醉； 2 解剖分割 迅速解剖，取出肝脏，在硬纸上用新单面刀片分割成0.5*0.5*0.5mm3 小块，迅速投入准备号的固定液； 3 前固定 2.5%戊二醛0~4℃固定1~2h（固定液需提前准备号）； 4 漂洗 0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次5～10min,0～4℃； 5 后固定 1％鋨酸固定1～2h，0～4℃； 6 漂洗 0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次5～10min,0～4℃； 7 脱水 30％乙醇→ 50％乙醇→ 70％乙醇，0～4℃，每步5～10min； 8 保存 70％乙醇0～4℃保存。 （五）实验要求 1 用具干燥； 2 取材 快、准、小、轻； 3 鋨酸有毒，需在通风厨中进行，含鋨酸的废液放入指定容器； 4 每人固定2～3块样品； 5 在固定的过程中要不断震动样品管。 二、样品的渗透与包埋 （一）实验目的 掌握超薄切片样品渗透与包埋的方法 （二）实验原理 见理论部分 （三）实验材料 上次保存的材料 （四）实验方法 1 脱水 85％乙醇→ 95％乙醇→ 100％乙醇→ 100％乙醇，每步5~10min； 2 置换 丙酮→丙酮，每步5~10min ； 3 渗透 1/2丙酮+1/2环氧树脂1~4h； 4 包埋 先将包埋模块加满环氧树脂，再将渗透过 的材料用牙签挑到包埋模块尖端部分，并在其中渗透3~4h； 5 聚合 加热37℃ → 45℃ → 60℃，各12h。 （五）实验要求 1 所用器具、工具保持清洁干燥； 2 手上若沾有环氧树脂，用丙酮棉球擦去； 每人包埋2～3个样品块。 三、修快与支持膜的制备 （一）实验目的 1 掌握超薄切片包埋块修快的方法； 2 掌握支持膜制备的方法。 （二）实验原理 见理论部分 （三）实验材料 上次实验包埋的材料 （四）实验方法 1 修快 （1）用样品夹头夹住环氧树脂包埋块的2/3左右，夹紧，或用手拿住样品块； （2）用小钢锉或单面刀片修快使达到下面要求：切面光滑平整，尽可能是要观察的材料，切面大小0.5*0.5mm2；3～4个斜面的坡度以45度为宜。 2 支持膜的制备 （1）将玻璃条、250ml烧杯洗净，玻璃条先用纱布擦干，然后再用绸布用力反复擦净，250ml烧杯装满蒸馏水； （2）将玻璃条放入0.2~0.3%聚乙烯醇缩甲醛的氯仿溶液中2~4cm深，停留3~5s后提出，在空气中自然干燥； （3）在玻璃条四周用单面刀片将膜轻轻划开，然后以与水面30度角缓慢插入放在日光灯正下方的250ml烧杯的蒸馏水中，同时用眼观察(使眼正好能看到水面反射的日光灯的光线)，使膜完全脱离玻璃条而漂浮在水面上，膜应为均匀的灰色（约15nm）； （4）将2～4片载网放在膜上，再用镊子轻压1～2下，使载网与膜紧贴； （5）再用比膜稍大的滤纸放在膜的上方，轻压下滤纸一角，在滤纸刚好全部湿润之际将滤纸提起，载网与膜亦贴在滤纸上； （6）将膜向上保存于培养皿中备用。 （五）实验要求 1 制膜所用的器具、蒸馏水、纱布、绸布必须干净，用后洗净，制膜过程要防尘； 2 每人修快2块，制膜2张，将修好的样品块用纸包好写上组号姓名； 3 预习下次实验。 四、玻璃刀的制作与超薄切片 （一）玻璃刀的制作 （二）超薄切片 五、电子染色 1 蜡盘的制作 在培养皿中注入融化的石蜡，让其逐渐凝固； 2 滴加染液 3 铀染 4 水洗 5 铅染 6 水洗 7 干燥 六、电子显微镜的使用与样品超微结构观察 （一）JEM-100SX透射电子显微镜的使用 1 启动：闭合电子显微镜稳压电源开关与冷却循环水稳压电源开光，压下启动按钮。约30分钟后仪器进入可工作状态。 2 放入样品：按程序放入样品。 3 加高压：有下列几档可选 40KV、60KV、80KV 、100KV，若需高压应先加低压。选择加速电压原则：电压越高，分辨率越高，反差越小；反之，电压越低分辨率越低，反差越大。 4 加灯丝电源：顺时针旋转至限位处（加灯丝电源必须有高压存在），此时应看到图象，若不能看到图象，请与专职人员联系，切勿随意调整各旋钮。 5 观察:调整放大倍数、亮度、样品XY平移、焦距进行观察。 6 照相：将要照相部位移至视野中心标记方框内，过卷，调整焦距、亮度至自动曝光两个绿灯同时亮，抬起荧光屏进行曝光。 7 关机：将放大倍数调至100