限制性内切酶酶切位点保护碱基.doc

寡核苷酸近末端位点的酶切( ()) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用γ[]在多聚核苷酸激酶的作用下标记单位的寡核苷酸。取 μ已标记了的寡核苷酸与单位的内切酶，在°条件下分别反应小时和小时。反应缓冲液含 ( ), , 及适量的或（视酶的具体要求而定）。的（ 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。 合成，新链的延伸方向是→因此，需要在端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个让它可以结合上去，否则会掉下来. 引物的结构就是（→）：保护碱基酶切位点原来的引物序列 首先要看目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选(小虾米酶切位点分析)。其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变 酶 寡核苷酸序列 链长 切割率                                                         ()                                                                                                                                                                                                                                                 合成，新链的延伸方向是→因此，需要在端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个让它可以结合上去，否则会掉下来. 引物的结构就是（→）：保护碱基酶切位点原来的引物序列