SangerSolexa测序原理和流程.pptVIP

目前华大的Sanger测序仪有以下两种： Megabace 96孔板，读长500bps，scf格式峰图 3730/3700 384孔板，读长700bps以上，ab1格式 质量的控制 用质量值Q来判断结果的可靠性 Q=-10*logX (X是单碱基错误率) Trim掉低质量序列，使用高质量序列 一些问题 为什么GC％过高或过低的DNA会造成测序困难？ 高质量的测序结果一定可信吗？ 引物在测序模板上的结合位置不唯一会导致什么后果？ 测序模板本身不唯一会导致什么后果？ 新兴的测序方法——solexa Solexa测序方法是由solexa公司（目前已被illumina兼并）开发的低成本高通量的测序方法。于2006年发布。 目前solexa测序的主要用途是重测序和表达分析，全基因组测序组装尚处在试验过程。 反应单位：cluster A C T G Cycle N Solexa的优缺点 优点 通量大，成本低（sanger法的1/100） shotgun测序的覆盖度和随机性相对较好 缺点 目前技术尚不成熟 读长太短，拼接难度大 Solexa数据 读长：35~75bps 时间：3days/SE36run 通量：1G/run 质量：理想情况下接近Q40标准 GC敏感度：相对低 为什么说solexa是“下一代”测序技术 反应模板的承载方式的改变 从孔到簇——从游离态到固态 反应控制方式的改变 从个体控制转为进程控制 最终结果是通量的飞跃——从点到面 测序的发展方向 质量 读长 通量 成本 测序原理和流程 引物和PCR 传统测序法——Sanger法 新一代测序法——solexa 引物和PCR 什么是引物 一小段单链DNA ，用来引发PCR反应 什么是PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 ，是复制DNA的反应。 做PCR的目的是什么 扩增。由DNA链上的已知片段向特定的区域延伸，从而得到特定区域的DNA。 变性 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 引物复性 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ P1 P2 延伸 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ P1 P2 再变性 首轮扩增结束 再复性 P1 P1 P2 P2 再延伸 P1 P1 P2 P2 第二轮扩增结束 P1 P1 P1 P1 P2 P2 P2 P2 第三轮扩增结束 轮次 长片段数量 目标片段数量 1 2 0 2 4 2 3 6 8 4 8 22 5 10 52 6 12 114 … … … 通过不断扩增延伸，长片段线性增长，而目标片段指数增长，最终反应主产物是目标片段 PCR扩增NGF基因（大鼠） rat beta-nerve growth factor sequence 5’- 301 gttctacact ctgatcacag cgtttttgat cggcgtacag gcagaaccgt acacagagat 361 caatgtccca gagggagact ctgtccctga agaccactgg actaaacttc agcattccct 421 ctgacacagc cctacgcaga gcccgcagtg cccctgctga accaatagct gcccgtgtga 481 agggacgacc cgcaacatca ctgtggaccc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc 541 accccgcgtg ctgtttagca cccagcctcc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc -3’ Primer 1: (5’) gat cgg cgt aca ggc aga ac (3’) 328-347 Primer 2: (3’) cgc ggg gtg aac gga gtc tc (5’) 529-548 预期扩增长度：220bp DNA Marker NGF ←2000bp ←1000bp ←750bp ←500bp ←250bp ←100bp 220bp→ 通过胶图验证PCR是否成功 PCR的特点和用途 灵敏度高、特异性强 1、获取DNA 2、验证 引物设计的基本原则 有效： 能结合到模板上 引物自身没有消耗 唯一： 一定范围内不错配 引物的自身消耗 发夹结构： 5’- ACATGAGGTACCAGCCCCATGT -3’ 5’- ACATGAGGTAC…