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第十六章 基因诊断Gene Diagnosis 基因诊断—以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程 第一节 基因诊断的技术方法 一、基因诊断中常用的分子生物学方法 ㈠ 核酸分子杂交 ㈡ PCR ㈢ SSCP（PCR-SSCP） ㈣ 限制酶酶谱分析 ㈤ DNA序列测定 ㈥ DNA芯片技术 ㈠ 核酸分子杂交 杂交双链的稳定程度主要由Tm值决定，影响Tm值的因素包括： 双链的碱基组成、长度、碱基错配程度 溶液离子强度 变性剂的影响 在无变性剂存在的情况下，最适杂交发生在比DNA/DNA Tm低20～25℃，比DNA/RNA Tm低10～15℃ ㈡ PCR 一般与其它技术合用 ㈢ 单链构象多态性（SSCP）检测 PCR- SSCP 由于检测点突变 ㈣ 限制酶酶谱分析 基因突变导致酶切位点的丢失或相对位置发生改变 ㈤ DNA序列测定 ㈥ DNA芯片技术 二、基因诊断的基本方法 基因变异致病的类型： 内源基因的变异 基因结构的突变 点突变、插入、缺失、重排、异位 基因表达异常 mRNA剪接异常 外源基因的插入 ㈠基因突变的诊断 点突变的诊断 ①诊断已知的点突变 （PCR/ASO） 一对探针 突变碱基置探针中央 控制杂交条件 结果分析： 反向杂交技术 基因芯片技术：可检测出新的突变类型 ②诊断未知的突变 PCR/SSCP/测序 DNA芯片技术 针对不同的点突变可采用的方法 PCR和限制酶酶解 PCR/ASOH 等位基因特异的PCR 变性梯度凝胶电泳 PCR/SSCP PCR/双脱氧指纹法（DDF） PCR/测序 少数核苷酸缺失或插入的诊断 大片段丢失或插入的诊断 PCR/多重PCR 基因重排（染色体易位）的诊断 基因扩增的诊断 ㈡多态性连锁分析 DNA多态性——在同种生物不同个体的基因组中，常存在一些不影响基因功能的DNA顺序变异，称为DNA多态性（polymorphism） DNA多态性标记 RFLP 短串联重复序列（short tandom repeat, STR） 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA→酶切→Southern杂交分析 DNA→PCR →酶切→电泳分析 由串联重复顺序导致的长度多态性 STR含有较高的信息量且容易检测 STR由2~6个核苷酸串联重复组成，微卫星DNA ㈢基因表达异常的诊断 mRNA的相对定量分析 斑点杂交或狭缝杂交 RT—PCR mRNA的绝对定量分析 RT—PCR/竞争性PCR mRNA长度分析 Northern杂交/ RT—PCR产物电泳 ㈣ 外源DNA检测 核酸分子杂交 PCR技术 第二节 遗传病的基因诊断 一、遗传性疾病基因诊断的策略 直接诊断 点突变 间接诊断 多态性连锁分析 镰刀型红细胞贫血症： 第六位密码由GAG突变成GTG 第三节 感染性疾病的基因诊断 一、感染性疾病基因诊断的策略 针对病原体特异的核酸序列设计探针进行杂交 应用PCR技术扩增病原体基因保守序列 核酸杂交技术与PCR技术联合应用 第四节 肿瘤的基因诊断 一、肿瘤基因诊断的策略 检测肿瘤相关基因 癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因 检测肿瘤相关病毒的基因 鼻咽癌—EB，宫颈癌—HPV 检测肿瘤标志物基因或mRNA 肝癌—甲胎蛋白（AFP） 结肠癌—癌胚抗原（CEA） 二、肿瘤相关基因的检测 ㈠ras癌基因的检测 ras基因中最常见的点突变是第12，13或61密码子突变 检测方法： PCR/ASO PCR-SSCP ㈡ p53的检测 p53基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子130~290 检测方法： PCR—SSCP PCR—测序 PCR—RFLP ㈢ 其它基因的 检测 PCR结合其它技术 基因芯片 第五节 基因诊断在法医学上的应用 DNA指纹 Southren blot * * 制备样品 制备探针 杂交 检测 获得满意的高特异性杂交的关键是控制好杂交条件和杂交后冲洗条件 *