基因导入受体细胞.pptVIP

β-半乳糖苷酶显色反应 应用载体系列，外源DNA插入到它的lacZ基因所造成的β-半乳糖苷酶失活效应，可以通过大肠杆菌转化子菌落或噬菌斑在Xgal-IPTG培养基中的颜色变化直接观察出来。β-半乳糖苷酶会把乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。 Xgal(5-溴-4-氯- 3-吲哚-β-D-半乳糖苷) IPTG(异丙基硫代半乳糖苷) 四、根据重组子结构特征筛选法 1、限制性核酸内切酶酶切筛选 2、利用PCR方法筛选 PCR电泳图 DNA样品限制酶 酶解 Southern blot * * 第五章 目的基因导入受体细胞 重组子分子导入受体细胞的途径 原核生物的转化与转染 真核生物的转染 原核生物的转化与转染 E.coli的钙转化 E.coli的电穿孔转化 转染 转导 E.coli的钙转化 细菌细胞在一定的生理状态（感受态），或经CaCl2处理，或制备成原生质体的情况下，都可吸收外源ＤＮＡ，利用这一特性可将重组ＤＮＡ导入受体细胞中，用质粒作载体的遗传工程一般使用这种方法。 由于E.coli不会自发地产生感受态，因此E.coli的转化一般采用钙转化法。该方法是将E.coli用冷CaCl2(0℃) 致敏，而后在高温（42 ℃）下热休克，这样可使外原DNA进入受体细胞。 E.coli的电穿孔转化 在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外原DNA进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高2~3个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染。 转染是指转化感染（Transfection来自于transfomation与infection） 凡是以噬菌体（如M13）或病毒为载体，以转化的方法将DNA导入细胞的方法均称为转染。因此转染就方法来说与转化是一样的。 体外包装颗粒的转导 将重组的 λ噬菌体DNA或重组的柯斯载体DNA经体外包装成具有感染能体力的λ噬菌体颗粒，然后经由在受体细胞表面上的λDNA接受位点，使这些带有目的基因序列的重组体DNA注入大肠杆菌。 真核生物的转染 1. 磷酸钙转染技术 2.电穿孔法 3.基因抢转染法 4.激光微束穿孔法 5.显微注射法 6.脂质体介导法 7.多聚物介导法 磷酸钙转染技术 主要用于动物细胞的转染。将DNA溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡下加入由Na2HPO4和NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将DNA导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免DNA被细胞内的核酸酶水解。 电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样，主要用于植物细胞的转染。 基因抢转染法：主要用于植物细胞的转染。利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先将DNA溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使DNA吸附在金属微粒表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。 激光微束穿孔法：主要用于叶绿体或线粒体的基因工程操作。利用直径很小、能量很高的激光束在细胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA进入细胞。 显微注射法：主要用于动物细胞或植物的原生质体，利用毛细管直接将DNA注入细胞内。 脂质体（liposome）介导法：主要用于动物细胞或植物的原生质体。将DNA包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将DNA导入细胞内。 多聚物介导法：用于动物细胞或植物的原生质体。利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而进入细胞内。 重组子分子的选择与鉴定 一、遗传检测法 二、物理检测法 三、菌落或噬菌斑杂交筛选法、 四、根据重组子结构特征筛选法 五、免疫化学检测法 六、蛋白质筛选法 七、转译筛选法 1、根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 （1）抗药性标记插入失活选择法 （2）β-半乳糖苷酶显色反应选择法 一、遗传检测法 抗药性标记插入失活 筛选重组子的示意图 利用菌落颜色筛选重组子 利用噬菌斑颜色筛选重组子 2、根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。 一、遗传检测法 Example: 将野生型的大肠杆菌DNA连接酶基因克隆到噬菌体λgt.λB噬菌体载体上。由于C片断的缺失而造成重