第三章细胞工程与食品产业.ppt

（4）固定化培养 在体内，细胞是在三维间质组织之中的，而固定培养正是模拟这个生理状态。用此法可达到较高的细胞密度，并且很多固定材料可保护悬浮细胞免受由于培养液流动产生剪切力的损害。 固定化培养既适用于悬浮生长的细胞，也适用于贴壁生长的细胞培养。 常用的细胞固定化方法主要有吸附、共价贴附、离子共价交联、包埋和微胶囊化。 各种固定化方法的特点 (i)吸附：选择适当的条件，将细胞和支持物混合，细胞便贴附在支持物表面。缺点主要是负荷能力低，有细胞脱落的危险。 (ii)共价贴附 ：细胞和支持物通过化学键结合，减少了细胞泄漏，但需要化学试剂处理，这对细胞活性不利。 (iii)离子共价交联 ：如果用聚合物(聚胺等)处理细胞悬液，聚合物则会在细胞之间形成桥使之絮结。通常细胞活性高，但机械稳定性差，时常还发生细胞泄漏。 (iv)微胶囊化 ：用一些无机溶剂和乳化剂将细胞包在半透膜中，这些试剂对细胞存在着潜在危险。微囊化的细胞具有抗机械剪切的能力，但由于半透膜孔径通常较小，大分子量的基质通常难以进入，由于这种扩散障碍，并不是使所有细胞都处于最佳状态。 (v)包埋 ：将细胞和多聚物或单体混合，随着凝胶的形成，细胞嵌入多聚物的网络中。此法步骤简单，条件温和，且负荷量大，细胞泄漏减少，多聚物网络能保护细胞抗机械剪切。当然，它亦存在一些缺点，如扩散限制并非所有细胞都能接触最佳基质浓度。由于大分子基质不能渗透多聚物网络，因而往往有一些物质被排斥在外。 2.3 细胞融合技术 细胞融合：是指不同的细胞在离体条件下接触，用无性的方法使其成为一体而产生杂种细胞的技术。植物细胞和微生物细胞常因有细胞壁不能直接用于融合，须经酶法除去细胞壁而得原生质体而后再进行融合，又称原生质体融合。 细胞融合的过程：细胞在促融因子的作用下，出现凝集现象，然后，细胞之间的质膜发生粘连，细胞开始融合，然后在培养过程中，进而发生核融合，形成杂种细胞。 细胞融合的方法 生物学法：采用病毒促进细胞融合。如仙台病毒（常用的细胞融合剂）。但这种方法存在着许多问题，如病毒 制备困难、操作复杂等，目前，这种方法主要适用于动物细胞融合，用于实验室研究。 化学融合剂法：如PEG法：融合的程序大致有以下几步：从双亲分别制备原生质体；混合二亲本的原生质体；诱导融合处理；缓缓加入几滴高pH高钙液，持续15分钟，加入冲洗液，最后将稀释液收集于离心管中，离心收集原生质体；将处理后的原生质体作镜检并作培养。 电融合法：这是80年代出现的细胞工程技术。采用直流电脉冲的诱导，可改变原生质体质膜表面的电荷，使异种原生质体粘合，并使原生质膜瞬间破裂，相邻的原生质体连接、闭合、产生融合体。电融合的优点是，对原生质体的损害小，融合率高、重复性强。另外，它省去用PEG诱导后必须洗涤的步骤，方法简单。缺点是必须购置专用的细胞电融合设备。 微生物原生质体的制备和融合 为制备微生物的原生质体，必须有效的去除细胞壁。革兰氏阳性菌易被溶菌酶除去壁，革兰氏阴性菌必须采用溶菌酶和EDTA一起处理。 微生物原生质体制备之前需经过种子培养、震荡培养到一定的对数生长期 微生物原生质体融合最常用的方法是PEG融合和电融合 植物原生质体的制备 植物原生质体的制备 （1）取材与除菌 取活跃生长的器官和组织 较脏的外植体要肥皂水清洗再以清水洗2-3次，再浸入70%酒精消毒，用3%次氯酸钠处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。 （2）酶解 为除去植物细胞的细胞壁，需经酶解。除菌后的叶片除去下表皮 切块放入反应液不时轻摇 反应液转绿。反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。 （3）分离 在反应液中除了大量的原生质体外，还有一些残留的组织块和破碎的细胞。为取得高纯度的原生质体需进行原生质体的分离。可采用过滤法、低速离心法或比重漂浮法。 （4）洗涤 刚分离得到的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养、再生的试剂，需用新的原生质体培养液离心洗涤2-4次。 （5）鉴定 确认是否已获得原生质体。比如放入低渗溶液中，很容易胀破的就是原生质体，也可用荧光增白剂染色后在紫外显微镜下观察。 植物融合子的鉴定 杂合细胞的显微镜鉴别：根据两亲本原生质体的形状和结构的差异来鉴别杂合体。如一方细胞基本无色，另一方为绿色，则白绿色结合的细胞就是杂合细胞。 互补法筛选杂合细胞 ：在获得各种遗传突变细胞株系的前提下，可用遗传互补法来筛选杂合子。如甲细胞株缺外源激素A不能生长，乙细胞株需要提供外源激素B才能生长，则甲株与乙株融合，杂合细胞在不含激素A、B的选择培养基上可以生长。 细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体：分子生物学的方法，如染色体核型分析、限制性内切酶片段长度多态性等分析融合子，以确定其是否结合了双亲本的遗传素质。 融合处理后再生长出的植