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EASY 克隆技术 北京全式金生物技术有限公司 EASY 克隆 分子克隆的传统方法 Topoisomerase (EASY)克隆原理 EASY 克隆策略 EASY 克隆成功的关键 EASY 克隆常见问题及解决方法 分子克隆的传统方法 分子克隆的传统方法 Vaccina Topoisomerase as Cloning Tool EASY 克隆原理 EASY 克隆 利用 Vaccina Virus Topoisomerase (TOPO) ，与载体结合 (牛痘病毒的拓扑异构酶) 酶特点： ? 由314个氨基酸组成 ? 识别5’-C/TCCTT-3’ ? 同时具有限制性内切酶(nick enzyme)和连接酶的功能; 工作所需缓冲液条件宽泛 ? 不需要外界提供能量 ? 80%的连接反应在2分钟之内即可完成 EASY 克隆过程: 三个简单步骤 EASY 克隆策略——对片段的处理 EASY克隆策略——对比载体EASY 克隆和T4 DNA Ligase克隆比较（Topo载体和普通TA载体比较） EASY 克隆成功的关键 引物设计、PCR条件 克隆反应设置 克隆感受态细胞的选择 选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒 （一）准备外源片段时的注意事项 引物设计：引物不能磷酸化。 PCR注意事项： ? 后延伸设置为72℃10～20分钟. 目的： 保证扩增片段完整,可以有效降低扩增背景； 使用Taq系列DNA聚合酶扩增时,该步骤为加A反应； ? Taq系列DNA聚合酶扩增(如EasyTaq, TransTaq-T等), 使用TA克隆载体； ?Pfu系列DNA聚合酶扩增(如EasyPfu, FastPfu等)， 使用Blunt克隆载体； ?复合DNA聚合酶(如TransHiFi, LA等)扩增， 使用TA载体, 也可用Blunt载体。 (一般推荐用TA载体,使用Blunt载体时克隆数较少)。 （二）克隆反应设置——连接时的注意事项 摩尔比: EASY 克隆DNA的工作浓度广泛。 通常产物在琼脂糖胶上可见时，加入1 μl 即可。 优化指南：如果按照上述操作未得到理想结果, 请按照以下具体要求调整： ? 1 kb 左右的片段: 20 ng DNA ? 2 kb 左右的片段: 40 ng DNA ? 3 kb 左右的片段: 60 ng DNA ? 可按“1Kb加入20ng”计算，如1.5Kb加入30ng ?片段加入的最大量: 4 ml, 浓度很低时也有一定的连接效率， 体积大于5 ml 会破坏反应体系平衡. ?片段加入的最小量: 0.5 ml, 浓度非常高时需要稀释, 否则易形成串连体 反应温度：Topo的工作温度为20℃～37℃，最适反应温度为25℃ 反应时间： 5～30分钟 克隆感受态细胞的选择 （三）其它注意事项 基因特殊结构： Why: 具有高AT, 高GC, 反向重复序列的基因, 不容易连接 Suggestion: 调整, 摸索连接体系和条件； 尝试不同的载体, （不同的骨架对片段偏好性不同） EASY 克隆常见问题及解决方法 克隆数少 (感受态细胞效率正常范围内) 菌落多为淡蓝色或 Fish Eye (白边蓝芯) 克隆阳性率低 PCR鉴定重组子失败 1. 克隆数少 （1）PCR产物不新鲜： Why: 3’-A 容易脱落, 导致T/A克隆效率低 Suggestion: PCR产物立即使用效果最好; 或将PCR产物置于4℃，保存1～2天内使用; 不要冷冻PCR产物 （2）目的片段浓度很低： Why:无法保证有效碰撞 Suggestion: 浓缩DNA Why: EB和紫外照射（UV短波长）对dsDNA造成损伤导致克隆效率降低, 阳性率减少, 突变率增加 (EB nicks DNA when exposed to light, which is promoted by shorter UV wavelengths, increased li