凯基高纯质粒小提试剂盒.DOC

Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 Cat：APW0006-20 APW0006-50 APW0006-100 组份 Annexin V-FITC染色液：100μl (APW0006-20),250μl (APW0006-50), 500μl (APW0006-100) Propidium Iodide染色液：200μl (APW0006-20),500μl (APW0006-50), 1000μl (APW0006-100) 10X binding buffer：2ml (APW0006-20),5ml (APW0006-50),10ml (APW0006-100) 储存条件：2-8℃避光保存 有效期：一年。 一、说明： 细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。 用标记了FITC的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生，正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。将AnnexinⅤ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+ /PI+ ）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+ /PI-）。（图1) 二、注意事项： 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。 Annexin V-FITC和Propidium iodide 是光敏物质，请注意避光。 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。 避免皮肤或粘膜与试剂接触。 三、试剂盒以外自备试剂和仪器 ● PBS ● 纯水 ● 移液器及吸头 ● 离心机 ● 流式细胞仪或荧光显微镜 四、操作步骤： 使用注意事项： 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。 Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光。 由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。 不需要固定细胞，否者可能对结果产生干扰。 对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色；处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞，胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI 摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应不用EDTA，EDTA 影响Annexin V 与PS 的结合。 成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功与否至关重要。 样品染色： 离心收集悬浮细胞，离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基。（贴壁细胞用胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性）。 用冷PBS洗涤细胞两次。（2000RPM，离心时间5min收集细胞）。 稀释binding buffer， 用400ul binding buffer悬浮细胞，浓度大约为1 X 106 cells/ml。 在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀后于2-8°C 加入10ul PI染色液后轻轻混匀于2-8°C 在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。 流式细胞仪分析： 经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。激发波长为488nm。 按照常规的流式凋亡检测的操作