植物花药培养及单倍体植株鉴定-2015资料.pptVIP

醋酸洋红染色法观察植物根尖细胞染色体 实验步骤：1、取材：烟草根尖。2、预处理：冷冻处理。 根尖置于冰水浴中，放到4℃的冰箱中处理24小时。 3、固定 冲洗干净处理的材料，卡诺氏液（冰乙酸：无水乙醇=1：3或冰乙酸：氯仿：无水乙醇=1；3：6）固定24h。 4、解离 取出4-5条根置于表面皿中，用蒸馏水冲洗3-4次，加入数滴1N盐酸于表面皿中，在酒精灯上间歇式加热2-4分钟。 5、染色 加几滴醋酸洋红于表面皿内，在灯上加热。取一根已染过色的根放在载玻片上，加一滴1%醋酸洋红溶液，盖上盖玻片轻敲盖玻片，使根尖压成一薄层。6、镜检 先在10倍下找到分裂相后，再换40倍观察。 四、注意事项 1. 提高诱导效率。 2. 降低白化苗的发生频率。 五、作业与思考题 1. 花药培养的一般程序； 附培养结果（照片） 2. 影响花药培养的因素； 诱导率/ %=(愈伤组织数/接种花药数)×100 出苗率/ %=(花药出苗数/接种花药数)×100 3. 单倍体植株的鉴定方法； 4. 单倍体育种的意义和不足之处。 胚状体形成： MS培养基（1/2大量元素+基本成分）+ NAA 0.2mg/L + 6-BA 2mg/L + 30g/L蔗糖+ 7g/L琼脂+ 1g/L活性炭，pH值5.5-5.8） 分化成苗： MS培养基（1/2大量元素+基本成分）+ NAA 2mg/L + 6-BA 0.2mg/L + 20g/L蔗糖+ 7g/L琼脂，pH值5.5-5.8 ） 胚状体形成： H培养基（基本成分）+ NAA 0.2mg/L + 6-BA 2mg/L + 30g/L蔗糖+ 7g/L琼脂+ 1g/L活性炭，pH值5.5-5.8） 分化成苗： H培养基（1/2大量元素+基本成分）+ NAA 2mg/L + 6-BA 0.2mg/L + 20g/L蔗糖+ 7g/L琼脂，pH值5.5-5.8 ） * * 植物花药培养及单倍体植株鉴定 20学时 安徽农业大学生命科学学院 高俊山 花药培养：是指将未成熟的花药接种在人工培养基上分化成为植株的过程。属于器官培养。 供体植株小孢子（n） 花培 花粉植株（n） 雄核发育 自然加倍 人工加倍 纯合植株DH（2n） 一年内获得纯系 常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。 一、实验目的与原理 原理： 利用组织培养技术对植物花药进行离体培养，诱导产生再生植株。通过形态观察和染色体分析鉴定单倍体植株，作为新的遗传资源和选择材料。 目的： 掌握植物花药离体培养技术； 掌握单倍体植株鉴定的方法； 了解单倍体育种的意义。 花药培养基本流程： 预处理花药（物理或生理逆境） 收集具有胚性小孢子的花药 培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体 胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株 选择合适的供体植株 单倍体植株鉴定 二、实验内容 1、镜检花粉发育时期 2、花药离体培养 2.1 取样 2.2 消毒 2.3 接种 2.4 培养 3、单倍体植株的鉴定 三、实验器材 材料：烟草花药。 试剂：MS培养基、N6培养基、B5培养基、酒精、2,4-D、NAA、KT、蔗糖、醋酸洋红、蒸馏水。 仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普通光学显微镜、微波炉、pH计、培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、镊子、剪刀、解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、封口膜、橡皮筋、低温冰箱。 四、实验步骤 1.适期花药的选择 花药中的花粉是由生殖细胞（体细胞）经过减数分裂而来，其染色体只是体细胞中的一半，如果通过一定的途径将花粉培养成植株，获得单倍体植株。再经过染色体加倍，得到纯合的二倍体，大大缩短育种进程。 一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。 形成双核后，在合适的条件下，主要由营养细胞分裂产生胚状体。 ? 花粉发育时期： 被子植物的花粉发育可分为四分体期、单核期（小孢子期）、二核期和三核期（雄配子期）4个时期。 四分体时期 单核靠边期 花药切片显微观察 花粉的发育 营养细胞 生殖细胞 精子 四分体: 醋酸洋红染色 四分体: Alexander’s 染色 单核期 双核期 成熟花粉粒 烟草花粉发育时期的检测： 一般将植物的花药置于载玻片上压碎，加1-2滴1%醋酸洋红染色，再进行镜检，以确定花粉发育时期。 单核晚期 ?液泡 第一次有丝分裂后期 双核早期 双核中期 ?生殖核 ?生殖核 营养核? 处于不同发育阶段的烟草花芽 烟草花粉发育时期的确定 烟草花粉培养，选择单核靠边期的花药，培养效果最好。 从烟草花的外部形态变化来看，当花蕾的花冠长度与花萼的长度相等时，花药里面的多数花粉粒正处于单核靠边的阶段。 不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期 发育时期 物种