基因制药-基因工程制药.ppt

第一节 概述 第二节 基因药物生产的基本过程 第三节 目的基因的获得 第四节 基因表达 第五节 基因工程菌的稳定性 第六节 基因工程菌发酵 第七节 基因工程药物的分离纯化 第八节 基因工程药物的质量控制 第四节 基因表达 进行基因研究，我们主要关心的是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此在进行基因表达设计时，需综合考虑各种影响因素以建立最佳基因表达体系。 一、宿主细胞的选择 宿主细胞应该具备的条件 （1）容易获得较高浓度的细胞； （2）能利用易得廉价原料； （3）不致病、不产生内毒素； （4）发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； （5）容易进行代谢调控； （6）容易进行DNA重组技术操作； （7）产物的产量、产率高，产物容易提取纯化。 一、宿主细胞的选择 基因表达有两类宿主细胞 （1）原核细胞：目前常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等； （2）真核细胞：常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 1、原核细胞 （1）大肠杆菌 大肠杆菌表达基因工程产物的形式 细胞不溶性表达（包涵体）； 细胞内可溶性表达； 细胞周质表达； 极少数情况下还可分泌到细胞外表达。 不同的表达形式具有不同的表达水平，且杂质的含量和种类也会变化。 （1）大肠杆菌 大肠杆菌中的表达的特点 ①不存在信号肽，产品多为胞内产物； ②分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包涵体，产物须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性； ③不存在翻译后修饰作用； ④翻译通常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应； ⑤产生的内毒素难以除去； ⑥ 产生的蛋白质酶会破坏蛋白质。 （2）枯草芽孢杆菌 分泌能力强，可以将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包涵体； 该菌也不能使蛋白质产物糖基化； 由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此在外源基因克隆表达的应用中受到影响。 （3）链霉菌 其是重要的工业微生物，近年来作为外源基因表达体系正日益受到人们的重视。 其主要特点是： 不致病，使用安全； 分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中； 具有糖基化能力，变铅青链霉菌限制修饰能力弱，可以作为理想的受体菌。 现已构建了一系列有效的载体，下游培养工艺也已经成熟。 2、真核细胞 （1）酵 母 特点：①真核生物细胞，故有后翻译过程；②基因组小，仅为大肠杆菌的4倍；③ 世代时间短，有单倍体和双倍体两种形式；④基因操作与原核生物相似；⑤可以建立有分泌功能的表达系统，将产物分泌出胞外，分离纯化工艺相对简单。 在各种酵母中以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的应用历史最为悠久，研究资料也最丰富。 （2）丝状真菌 近年来，已在约30种以上丝状真菌中建立了DNA转化系统 特点： 有很强的蛋白分泌能力； 能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等，而且其糖基化方式与高等真核生物相似； 丝状真菌（如曲霉等）等又确认是安全菌株，有成熟的发酵和后处理工艺。 （3）哺乳动物细胞 哺乳动物细胞由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，细胞培养成分完全由人控制，从而使产物纯化变得容易。 哺乳动物细胞分泌的基因产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。 但动物细胞生产慢，产率低，且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。 去除附加的甲硫氨酸有两种方法： （1）在表达系统中共表达甲硫氨酸氨肽酶基因。 （2）在分离纯化后在体外用外肽酶处理。 但它们都对与甲硫氨酸相邻的氨基酸残基类型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。 三、酵母中的基因表达 酵母表达系统是随着酵母质粒和酵母转化技术的建立而逐步发展起来的，其与其它表达系统一样，包括载体、启动子等控制序列和宿主细胞3个部分。 1、载 体 （1）载体的复制序列：根据来自酵母的复制序列的构成和特性。载体可以分为四大类： ①Yep类（yeast episomal plasmid，酵母附加体质粒），这类载体的复制序列为酵母2?质粒成分。 2?质粒是多数酿酒酵母中天然存在的质粒，长6.3kb，可独立复制。将2?质粒中复制起点区及REp3基因区的序列引入载体，就足以维持在大多数酵母株系中的复制能力。以2?质粒为基础的载体，因具有较高的拷贝数、转化频率和稳定性而被广泛使用。 ②Ypp类（yeast replicatio