流式细胞仪的荧光补偿问题.pptVIP

1.荧光素为什么会出现荧光？ 2.检测前为什么需要进行荧光补偿？ 3.荧光补偿的方法有哪些？ 4.荧光补偿的原则是什么？ 荧光发生的机理 室温下荧光素分子大部分处于“基态”，当荧光素在一定波长（激发波长）的光的照射下吸收光能后（经染色后的细胞在激光束的照射下），荧光染料吸收能量能级跃迁，进入新的状态，称为“激发态”，处于激发态的分子极不稳定，它可以通过在10-9－10-7秒的极短时间内以发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。 荧光素的激发光谱和发射光谱 任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱 激发光谱（Excitation，Ex）： 是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。 吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max 发射光谱（Emission）： 是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光。 发射波峰（最大发射波长）：Em-Max 发射波峰--最大发射波长 PE--藻红蛋白 荧光染色对照的设置 阴性对照 空白对照（自发荧光） 同型（ISO)对照（自发荧光＋非特异荧光） 实验样本（特异荧光＋自发荧光＋非特异荧光） 荧光染料平均荧光强度比较 同型对照的选择 与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型； 与染色的单克隆抗体 ①相同种属来源 ②相同免疫