高中生物(必修)第二册第六章第四节 重组DNA.pptVIP

11 重组DNA技术 11.1 重组DNA技术是基因工程的核心技术 11.2 获得需要的目的基因（外源基因） 11.3 构建重组质粒和基因克隆 11.4 转化受体细胞和转化子的筛选 11.5 转化子的分析——Southern杂交 基因工程(genetic engineering) 所谓基因工程(genetic engineering)就是把外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制，转录，翻译表达的操作叫基因工程。 基因工程可使另一种生物获得新的遗传性状或表达所需要的产物。 PCR(多聚酶链式反应) 分子刀-DNA限制性内切酶 重组DNA的操作 载体 载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具， （1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制 （2）具有合适的限制性酶切位点 （3）具有合适的筛选标记 （4）细胞内拷贝数要多 （5）载体的分子量要小 （6）细胞内稳定性高 目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。 质粒载体的一般结构 DNA克隆常用载体 宿主菌或受体细胞 大肠杆菌 酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞 感受态细胞（competent cell） 筛选克隆 鉴定克隆---Southern分子杂交 The Human Genome Project  基因组 细胞内染色体的总和，基因组亦称染色体组 研究目标 拟在15年内至少投入30亿美元，完成对人基因组30亿个碱基对的顺序分析，完成对人基因组中全部碱基定位，并开展模式生物基因组研究。 基因组大小 生物 1013kb 大肠杆菌 4.67 酵母菌 12.1 线虫 97 果蝇 160 小鼠 3000 人 3000 绘制4张图 经典遗传图 物理图 DNA序列图 基因转录图 重组频率 Y w v m 0 1.3 30.7 33.7 m,v 3.0% m,y 33.7% V, w 29.1% W,y 1.3% 重组DNA技术的一般操作步骤有：(1)获得目的基因；(2)构建重组质粒；(3)转化受体细胞；(4)筛选和鉴定转化子；(5)培养转化细胞获得所需性状或所需产物。 获得目的基因的方法有：提取总DNA构建基因文库并从中调用；以mRNA为模板合成互补DNA片段；利用PCR特异性扩增所需目的基因片段等。用紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。 用限制性内切酶识别并切开核酸序列特定位点，将外源基因插入到载体中，用重组载体转化宿主细胞，外源基因将随宿主的繁殖而复制，这种过程称为基因的克隆。 凝胶电泳是用于分离、纯化和鉴定DNA片段最常规的实验技术。可依据DNA分子的大小来使其分离。还可以利用DNA杂交技术直接鉴定带有重组质粒的细菌克隆。 利用载体法或基因直接转移等技术将外源目的基因转入合适的宿主细胞中进行表达，获得所需表达产物或所需性状。用Southern杂交对转基因生物外源目的基因进行检测分析。 思考题 克隆载体包括哪些基本的结构元 件, 简述DNA克隆的过程? pUC18载体还携带了抗生素（antibiotic）基因，可筛选重组质粒。 一般克隆基因的检查和鉴定方法 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段： 磷酸基团带负电荷 酶解片段向阳极移动 电场驱动力和凝胶阻力 ——不同迁移率 分子量标准参照物 酶切和电泳方法 Restriction mapping 酶切 克隆基因的检查和鉴定方法 32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法 DNA杂交直接鉴定 植物遗传转化常用的方法 载体法转化——农杆菌介导法（Ti质粒） 基因的直接转移 （1）高压电脉冲电激穿孔 （2）基因枪法 （3）微注射法 构建缺失chlL基因的蓝细菌突变株（直接转化重组质粒） 纪念发明者Edward Southern （1）提取总DNA （2）酶解 （3）电泳 （4）转移到滤膜 （5）变性解链 （6）DNA探针及杂交 （7）洗脱 （8）放射自显影 （9）比较分析 11.5 转化子的分析——Southern杂交 Southern杂交分析示例