蓝圆鲹肌肉脯氨酸内肽酶及其内源性抑制剂的研究-生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 集美大学 集美大学硕士学位论文 蓝圆鲹肌肉脯氨酸内肽酶及其内源性抑制剂的研究 唐俊 学术诚信声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取 得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。本人依法享有和承担由此 论文产生的权利和责任。 声明人（签名）： 时 间： 保护知识产权声明 本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以 用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 作 者（签名）： 导 师（签名）： 时 间： 蓝圆鲹肌肉脯氨酸内肽酶及其内源性抑制剂的研究 摘 要 脯氨酸内肽酶（Prolyl endopeptidase，PEP）属于丝氨酸蛋白酶家族中的一种特殊的 切割多肽链中脯氨酸残基羧基端的内切酶，广泛存在于动物、植物和微生物等生物体内。 PEP 参与生物体的多种生理、病理过程，并在医药领域得到了一定的应用。但是，国内外 对于鱼类 PEP 的研究报道还比较少，特别是 PEP 如何参与鱼类肌肉生理变化过程还未见 报道。鉴于此，本研究从蓝圆鲹肌肉中分离纯化出 PEP 并对其性质进行了相关研究，进 一步探索了 PEP 的内源性抑制剂，以期为揭示脯氨酸内肽酶在鱼类肌肉中的功能特性奠 定理论基础。 通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephacel 阴离子交换层析、Phenyl-Sepharose 疏水层析 和 Q-Sepharose 阴离子交换层析等方法从蓝圆鲹肌肉中分离纯化得到一种脯氨酸内肽酶。 SDS结果显示蓝圆鲹 PEP 分子量约为 82 ku。对 PEP 的肽指纹质谱分析得到 169 个氨基酸残基，与墨西哥鲷鱼（Neolamprologus brichardi）PEP 的同源性为 98.8%，证明 纯化的蛋白为脯氨酸内肽酶。 酶学性质分析表明，PEP 的最适温度和最适 pH 分别为 35 ℃和 6.0，且在低温与 pH 5.0-7.5 范围内较稳定。通过热失活动力学方法测定该酶表观热失活速度常数可知，在一 定的温度范围内，随着温度的升高，酶促反应速度提高，酶失活所需要的时间也变短。底 物特异性研究显示 PEP 能够特异分解肽链羧基端含有脯氨酸残基的荧光底物，而对其他 底物则基本不分解。PEP 的特异性抑制剂 SUAM-14746 和丝氨酸蛋白酶抑制剂 PMSF 可 有效抑制 PEP 的活性，而其他蛋白酶抑制剂则对 PEP 没有抑制作用，表明 PEP 是一种特 异性的丝氨酸蛋白酶。 将蓝圆鲹 PEP 分别与三个合成的鱼类胶原蛋白小肽进行反应，利用反相高效液相色 谱进行分离，结果显示 PEP 能够水解分子量小于 30 个氨基酸残基的胶原蛋白小肽。电喷 雾质谱分析结果显示 PEP 的水解位点位于脯氨酸残基的羧基端。因此推测，PEP 参与到 鱼肌肉生理变化过程中，协同金属蛋白酶，通过特异性切割脯氨酸残基的羧基端降解胶原 蛋白小肽。PEP 是与鱼胶原蛋白新陈代谢密切相关的一种重要蛋白酶。圆二色谱扫描结果 显示，PEP 是一种以β折叠为主的蛋白质。 进一步通过热处理、硫酸铵盐析、Q-Sepharose 阴离子交换层析、Sephacryl S-200 凝 胶过滤层析和 Capto Q 阴离子交换层析等步骤从蓝圆鲹肌肉中分离纯化出一种 PEP 的内 源性抑制剂。SDS显示其分子量约为 16 ku。对其进行了两次肽指纹质谱分析，结 果与半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis ）核苷二磷 酸激酶 A 和无须鳕鱼 （Macruronus I novaezelandiae）核苷二磷酸激酶 B 同源性分别达到 100%和 94%，表明所纯化的 PEP 内 源性抑制剂是核苷二磷酸激酶。该抑制剂具有较好的热稳定性和 pH 稳定性，在高达 100 ℃下加热 30 min 抑制活性也可以保持 70%以上。在 pH 4.0-12.0 的范围内抑制活性变 化很小，但在 pH 3.0 的条件下稳定性变差。该抑制剂对 PEP 有竞争性可逆抑制作用， 但对其他类型蛋白酶没有抑制效果。本研究揭示了核苷二磷酸激酶这一多功能蛋白质可以 作为 PEP 内源性抑制剂的重要事实，为深入研究两者之间的作用关系奠定了基础。 关键词:脯氨酸内肽酶；蓝圆鲹；纯化；胶原蛋白小肽；抑制剂；核苷二磷酸激酶 II Study of a Prolyl Endopeptidase and its endogenous inhibitor from blue scad (Decapterus maruadsi) muscle Abstrac