辣椒疫霉纤维素合酶CesA3基因的克隆、原核表达及遗传转化研究-植物病理学专业论文.docxVIP

辣椒疫霉纤维素合酶CesA3基因的克隆、原核表达及遗传转化研究-植物病理学专业论文.docx

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万方数据 万方数据 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师指导下进行研究工作所取得的研究 成果。除文中已经注明引用的内容外,本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已 公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个 人和集体,均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名: 年 月 日 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定,非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申请和相关部 门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文,公开学位论文本说明为空白。 论文题目 申请密级 □限制(≤2 年) □秘密(≤10 年) □机密(≤20 年) 保密期限 审批表编号 批准日期 摘要 摘要 摘要 目前,辣椒疫病(pepper phytophthora blight)已成为影响辣椒生产的主要病 害,不仅造成辣椒产量的降低,更给我国及其他国家带来了极大的经济损失。 辣椒疫病是由辣椒疫霉菌引起的,辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)能 够在土壤中长期存活且适应性强,对于该病菌的防治当前主要依赖农药。施用 羧酸酰胺类(Carboxylicacid amides, CAAs)这一对卵菌病害防治效果杰出的杀菌 剂,已成为防治辣椒疫病的主要方法。该类杀菌剂由肉桂酰胺、缬氨酰胺氨基 甲酸酯和扁桃酰胺类 3 组化学结构各不相同的化合物组成。据已有的研究表明, 这 类 杀 菌 剂 的 作 用 位 点 可 能 为 编 码 纤 维 素 合 酶 复 合 体 (cellulose synthase complexe),本文的研究即主要围绕靶标蛋白纤维素合酶 CesA3 展开。通过克隆 基因、构建表达载体等分子生物学手段,在大肠杆菌内表达该蛋白,并通过构 建多种原核表达载体和更换不同表达菌株,摸索该蛋白的最佳表达条件,为以 后进一步了解该蛋白特性打下基础。 普通浮萍(lemna minor)是浮萍科植物的一种,为单子叶水生漂浮植物。由于 浮萍根系在水中,与陆生植物相比较,对于水中溶解的化合物吸收效果更好。 利用浮萍具有生长速度快、形态结构简单、生存环境条件易于控制的特点,本 课题将浮萍应用到农药生物测定工作中。通过使用转基因技术在浮萍中表达外 源细胞壁纤维素合酶,以转基因浮萍为基础,将传统的种辣椒、接菌、施药的 农药生物学活性测定方法转变为使用含药培养液处理浮萍这种简单的方式。在 克隆了 辣 椒 疫 霉 纤 维 素 合 酶 基因 CesA3 基 础 上 , 将 其 与 植 物 表 达 载 体 pCAMBIA1301 连接,用农杆菌介导的遗传转化方法侵染浮萍愈伤组织,获得转 CesA3 基因浮萍。经抗生素筛选和分子鉴定,得多株稳定的转基因株系。RT-PCR 结果显示 CesA3 基因已在浮萍中转录。通过不同浓度梯度含烯酰吗啉药剂的 Datko 培养转基因株系一周,之后称取浮萍干重。通过数据处理发现转 CesA3 基 因的株系抗药性高于野生型,进一步测定叶绿素含量也得出相近的结论。这为 建立以转基因浮萍为检测对象的农药生物学活性评价方法奠定了基础。 除了围绕纤维素合酶(CesA3)进行工作,还对本实验室合成的三种活性较好 的杀菌剂的作用机理进行了实验,在离体活性方面测定了药剂对菌丝生长、孢 I 子囊形成及萌发的抑制率。在活体活性方面测定了药剂对植物的保护、治疗活 性和内吸性。通过收集整理数据发现,与商品化农药烯酰吗啉对比,wzp 8-32 样品综合防治效果接近烯酰吗啉,个别指标甚至优于烯酰吗啉。 关键词:辣椒疫霉;羧酸酰胺类杀菌剂;CesA3;浮萍;生物活性 II Abst Abstract Abstract Pepper blight is a devastating plant disease which commonly occurres worldwide. It is also one of the most serious soil-borne diseases. Once pepper blight happens, it causes great economic losses to our country and other countries. Pepper blight is caused by Phytophthora capsici, which is a facultative parasite and can survive for long-term in soil. The main way to prevent this disease is dependent on chemical

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