第二章--柱、纸色谱(4h).pptVIP

第二章 柱色谱法和纸色谱法 第一节 柱上色谱法 柱上色谱可分为: 柱上吸附色谱法、 柱上离子交换色谱法、 柱上分配色谱法、 柱上凝胶色谱法。 。 柱上色谱法是比较古老的（1903年，Tswett提出来）。由于此法分离效率低，速度慢，因之在五十年代以前为主要的分离技术，但五十年代后，由于其它色谱技术（薄层色谱、气相色谱）的出现，其应用受到很大限制。 但是由于此种方法所用设备和操作方法都比较简单，可处理大量样品，在有机分析中，主要可用于有机样品的提纯（脱脂、脱色、脱胶、脱水），初步分离或制备纯样品等，因之该法仍然为人们所采用。 此外，随着天然产物化学的发展，许多天然有机物的应用价值日益提高，而这些化合物往往又难于合成，因之从天然界提取就成了唯一来源，这就必须采用制备型柱色谱技术。故柱色谱也是植物化学工作的主要技术之一。 1．柱上吸附色谱法 原理： 按照各组分在吸附剂上的吸附能力大小来分离的。 吸附剂的选择（凭经验决定 ）： 一种合适的吸附剂应该具备这样一些条件： （1）它能够可逆地吸附待层析的物质； （2）它不会引起被吸附物质的化学变化； （3）它的粒度大小应该能使显层剂以合适的速率流过； （4）吸附剂最好是白色的或浅色的，以便于对色层带进行观察； （5）颗粒具有一定的机械强度，操作时不易破碎； （6）不能与待分离物质及流动相产生化学反应，也不应相互溶解。 一般弱极性溶质宜选用强极性吸附剂，而强极性溶质宜用弱极性吸附剂。 最常用的吸附剂：氧化铝和硅胶。它们能符合上述要求，并且经过不同处理可以随意得到不同的活度。例如，氧化铝可以在不同温度烘干达到各种不同的活度。 必须指出，活性大的吸附剂用于色谱法并不一定最合适，因为活性太大，物质被吸附得太牢，以致不易被洗脱下来。 其他较常用的吸附剂有： 氧化镁（用于吸附烃、醇、酮、醚及硝基物等），碳酸钙（用于吸附叶绿素） 硫酸钙（用于吸附花色苷、维生素K1），氧化钙、氧化钛、碳酸钡、硫酸镁、无水碳酸钠（应用于吸附叶绿素），滑石粉（用于吸附有机酸、酚类、2,4-二硝基苯腙），硅藻土、蔗糖（用于吸附叶绿素）及淀粉等。 许多吸附剂遇水即失去活性，这时只能用无水溶剂。 实验技术 吸附剂的粒度及用量：一般在80~300目间变动。粒度细，分离效果好，但速度太慢。吸附剂的用量，一般为样品的30~50倍，有时达100倍。 色谱柱：很简单，只需要一支适当长度、适当口径的玻璃管，管下口做一紧缩处及一斜口，再连一个吸滤瓶即可。柱长与内径之比在10 ﹕ 1 ~ 4 ﹕ 1间较好。 装柱方法有两种：干法装柱，将吸附剂由柱口装入，边装边轻敲打，以使吸附剂装填密实均匀。吸附剂装完后，把淋洗剂沿管壁轻轻加入，使之浸润吸附剂，淋洗剂加入后发现柱内有气泡时，可敲打柱体或施加适当压力以压缩气泡，使气泡随淋洗剂一起排出。湿法装柱，有两种操作方法：方法Ⅰ：先将柱体下端活塞拧死，向柱内加入一定高度之淋洗剂，然后将吸附剂自上端慢慢加入，淋洗剂的液面一定要高出吸附剂层。吸附剂加完后，打开活塞，放出淋洗剂，直至吸附剂层不在沉降为止。方法Ⅱ：将吸附剂用淋洗剂调成糊状，慢慢倒入柱中，在保证淋洗剂液面略高于吸附层条件下，让淋洗剂自柱中慢慢流出，直至吸附剂沉降不在变动为止。不论何种方法装柱，要求装好之柱体密实均匀，无气泡，在淋洗过程中无裂纹出现，一般湿法装柱比干法好。 被分离样品的准备：柱色谱所用样品溶液一般配成较浓的溶液，最好为饱和液，这样样品加到柱顶集中，分离效果好，配制样品所用的溶剂极性要小，以利于样品立即被吸附剂吸附。如果样品在低级性的溶剂中溶解度很低，最好将样品用一合适的溶剂溶解，再与吸附剂相拌，低温烘干待上样。 上样：样品溶液配好后可开始加样，方法为当柱内淋洗剂流至液面与吸附剂面相平时，将样品溶液沿管壁加入柱内，注意不要让样品溶液自由落下而打乱柱顶吸附剂层。当样品液面和吸附剂面相平时，用样品溶剂数滴沿管壁加入，以洗净管壁上的样品液，当液面与吸附剂面再次相平时，加入显层剂进行显层。如果是和吸附剂相拌的样品，将柱内淋洗剂不要流至与吸附剂面相平，要保持一定的淋洗剂高度，将样品粉末缓缓地加入，并轻轻敲击柱子使气泡充分地排除，加完样品后，让淋洗剂流至与吸附剂表面相平，用样品溶剂数滴沿管壁加入，以洗净管壁上的样品液，当液面与吸附剂面再次相平时，加入显层剂进行显层。 显层: 使样品各组分在柱内进行分离的过程叫显层，此过程中所用的溶剂叫显层剂。 显层剂的选择 :一般来说，显层剂的极性比样品极性小些。常用的显层剂有石油醚，二硫化碳，苯，四氯化碳，氯仿（代表弱极性显层剂），乙醚，异丙醚（中等显层剂），低分子量的醇、酮（强显层