大学分子生物学经典教案第七章分子生物学研究方法(上).pptVIP

分离mRNA的试剂盒 可应用Promega PolyAT tract mRNA分离系统分离poly(A)mRNA。将用生物素标识的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。 三、 cDNA 的合成 可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA； 应选用活性较高的反转录酶（Reverse transcriptase）； 应选用甲基化dCTP(防止被限制性内切酶切割)； 应保证所获得双链cDNA的方向性(cDNA两端加上不同内切酶所识别的接头序列); 因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5’-methyl C的外源DNA，所以，应选用mcrA- ,mcrB-菌株。 定向cDNA的合成及分子修饰 四、cDNA文库 将某种细胞的全部mRNA通过逆转录合成cDNA，与载体连接，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为cDNA 文库。cDNA文库具有组织细胞特异性。 构建cDNA文库，材料来自mRNA cDNA文库只含有mRNA的分子结构, 不含真核基因的间隔序列和调控区。 cDNA文库的特点： ①出发材料是一定时空条件下的细胞总mRNA, 在转录水平上反映生物在特定发育时期、特定组织(或