生医工程试验.pdf

生醫工程實驗 第二組： 電機三 吳政穎 電機三 林王安 實驗一、生物晶片實習 電機三 黃大又 From: /classes/bme210/Spring07/Bio210-Lect1-Apr9.pdf 實驗原理： Microarray微陣列法為 Brown P. 等人於1995 年首度提出，亦是最早利用植物素材來剖繪基因 表現(Gene expression profiles)差異的方法。其流程為 (a). 經由聚合鏈鎖反應(Polymerase chain reaction, PCR)且純化之基因片段以微矩陣佈放方 式，再配合化學方法，將DNA固定於載玻片上。 (b) 以分別標示上不同波長螢光分子的實驗及對照組核酸，同時與載玻片上的基因進行雜交 反應。 (c) 經過雷射光的激發及掃瞄後，放射出來的兩種波長的螢光可同時被收集並數位化，以用來 估量基因表現的程度。此為目前技術最成熟，使用最廣泛的生物晶片類型之一。 實驗流程： PART Ⅰ：預備實驗 這部份的實驗是要我們養成正確使用 micropipet 的習慣。由於整個實驗的成功與否與pipet 的 使用有很大的關係，再加上 pipet 也不便宜，因此必需有正確的使用方法。 1. 使用 pipet 量取最大刻度的一半的水。 2. 精密量測所取到的量，和取同樣體積的同學比較值是否正確。 ★ Pipet 的使用上，比較需要注意的有： 1. 使用前轉到欲取的體積刻度，由大刻度往下轉較精確。 2. 不要用手去碰Tip ，直接以pipet 插入前端，再利用 pipet 的退Tip 鈕將之卸下。 3. 吸的時後只壓第一段，放的時後先壓第一段再壓第二段。 4. 如果使用 pipet 加入溶液，應儘量避免造成起泡。 5. Tip 使用後，應卸下換新的 tip 再量取其他溶液，避免之前的溶液殘留影響。 討論： 請就你練習使用的結果討論你所使用的 Micropipet 是否準確？假如不準的話，可能是由於哪 些原因造成這樣的結果？ 基本上量到的值誤差也都在一定的範圍之內，但由於儲存量測到的液體的容器，每個都 有點誤差，因此我們無法直接判斷量到的是否精準。再加上 pipet也有精準位的極限，使用越 大刻度的pipet誤差相對的比較明顯，而使用者的不當使用也會造成量測時的誤差。 PART Ⅱ：生物晶片實驗 現在開始這次的實驗，整個實驗需兩天的時間完成。 第一天實驗： 主要是做Target labeling和 Hybridization的動作： 目的： 兩管的mRNA ，經反轉錄成cDNA ，在反轉錄期間分別在cDNA尾端（ UTP ）或頭端（GTP ） 加入一種螢光標識，染有螢光黃（Cy3 ）的及染有玫瑰紅螢光染劑（Cy5 ）。而加上螢光染劑 原理是將原本鍵結 T或 G的打掉，換成含有螢光染劑 U或 G 上去。 1. 取兩管 RNA ，分別取20μg ( Cy3管 )和 40μg ( Cy5管 ) 。( 20μg 6.75μL , 40μg 13.5μL ) ☆ 需注意每次配出來的purified RNA濃度都不同，因此要計算適量體積來實驗。 2. 兩管加入poly dT 2μL 。 3. 兩管加入DEPC ddH2O 至19μL 。 兩管於65°C下混合加熱約 15 分鐘。 Supertanscript reaction mixture ：取另一管eppendorf配製此溶液 4. 混合 5X first strand buffer 17.6μL , 20 X low T-dNTP 4.4μL , 0.1M DTT 8.8μL , RNasin 2.2μL , Superscript II 4.4μL ，配製溶液等下使用( ＊) 。 ☆這裡我們使用的是更小刻度的 pipet(10μL ) ，以取到更精確的體積。 ~15 分鐘過後~ 5. 17μL Cy3 Cy5 各取 (