线粒体染色实验报告詹纳斯绿B课件.docVIP

细胞生物学实验报告 小鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 1. 实验目的：学习超活染色的原理及方法，用詹纳斯绿 B 给小鼠的肝细胞线粒体染色。 2. 实验用品： （1） 仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴 管、双凹载玻片 （2） 实验药品：蒸馏水、 Ringer 液、詹纳斯绿 B 染液 （3） 实验材料：小鼠 3. 实验原理： （1） 活体染色又称超活染色， 是指对生命有机体的细胞或组织能着色又无毒害的一 种染色方法。这种染色方法常用的是化学染料。 目的：显示生活中细胞的某种结构，不影响细胞的生命活动或产生任何的物理、化 学变化以致细胞的死亡。 应用：研究生活状态下细胞的形态结构和生理病理状态。 （2） 通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。 体外活体染色又称超 活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料 被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内 某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学” 特性。碱性染料的胶粒表面带阳离 子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子， 而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子， 这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色，理论 上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一 般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质 ( 如卵磷脂、 胆固醇等 ) 的特性， 易于被细胞吸收。 詹纳斯绿 B(Janus green B) 和中性红 (neutral red) 两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料， 对于线粒体和液泡系的染色分别 具有专一性。 （3） 选择活体染料的原则： ① 性质：有电化学特性 ② 低毒、无毒 ③ 低浓度：如实验中使用的是 1/5000 的詹纳斯绿 B 染液 ④ 专一、特异性：中性红可特异性地对植物液泡染色 ⑤ 常以碱性染料为主，因为碱性染料多可溶于类脂，容易穿膜。 4. 实验步骤： （1） 用断头法处死小鼠，置于解剖盘中。剪开腹腔，取出肝脏。选取边缘较薄 2 的肝组织 0.5cm 放入小烧杯中，用 Ringer 液冲洗去血污。 （2） 滴加 1/5000 的詹纳斯绿 B 染液于双凹片的凹穴中， 再将上述洗净肝组织移 入染液染色 20~30mins。以组织边缘被染成蓝绿色为准。 （3） 吸去染液，重新把组织置于小烧杯中。滴加 Ringer 液约 0.5mL，用剪刀充 分剪碎组织制成悬液。 （4） 静置上述悬液 1~2mins，取静置好的悬液滴片，加盖玻片，高倍镜下观察。 5. 实验结果：视野中可见比较大的、呈圆形的肝细胞，此种细胞内有一些小颗粒被染成蓝 绿色，就是线粒体。视野中也有一些较小的细胞，有些可看到红色，是血细胞。 10*40 显微镜下观察： 6. 分析与讨论 （1） 结果分析：部分肝细胞的线粒体被染成绿色 （2） 注意事项 ① 取肝组织：取肝组织时，应注意选择肝的边缘部分，这一部分组织的厚度差比 较明显；在染色时，须留出一部分肝组织暴露在空气中，以保持细胞呼吸，从 而使细胞存活。因此，厚度差比较明显的组织是比较好的实验材料。 ② 洗肝组织：肝组织一定要用 Ringer 液洗干净，否则观察时会看到很多血细胞， 影响效果。 ③ 在用染色：染色过程为 30mins，在这一过程中，染料中的水分很有可能蒸发， 因此，应不时滴加染料。 ④ 剪肝组织： 剪肝组织之前， 应滴加约 0.5mL 的 Ringer 液，Ringer 液不可过多， 否则很难剪到肝组织。剪碎后，应补充 Ringer 液至 1mL，再静置滴片。 7．作业：液泡染色原理： （1） 蟾蜍胸骨剑突软骨细胞液泡系活体染色： 在动物细胞内， 凡是由膜所包围的小泡和 液泡除线粒体外都属于液泡系，包括高尔基器、溶酶体、微体、消化泡、自噬小体、残 体、胞饮液泡和吞噬泡， 都是由一层单位膜包围而成。 软骨细胞内含有较多的粗面内质 网和发达的高尔基复合体，能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原纤维等，因而液泡系发达。 中性红是液泡系特殊的活体染色剂， 只将液泡系染成红色， 在细胞处于生活状态时， 细 胞质及核不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。 （2） 植物细胞的活体染色： 活体染色是利用某种对植物无害的染料溶液对活细胞进行染 色的技术。中性红是常用的活体染料之一，它是一种弱碱性 pH 指示剂，变色范围在 pH6.4~8.0 之间 (由红变黄 ) 。 在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性 红并向液泡中排泌， 由于液泡 在一般情况下呈酸性反应。 因此， 进入液泡的中性红便解 离出大量阳离子而呈现樱桃红色， 在这种情况下， 原生质和细胞壁一般不着色； 死细胞 由于原生质变性凝固