凝胶层析法分离纯化蛋白质.pptx

凝胶层析法分离纯化蛋白质 【目的】掌握凝胶层析的基本原理学习利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能 【原理】 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。凝胶过滤层析 凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。 单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶基质凝胶珠小分子大分子凝胶过滤层析过程示意图总结：相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。【实验器材】层析柱恒流泵紫外检测仪部分收集器试管等普通玻璃器皿【实验试剂】待分离样品葡聚糖凝胶 Sephadex G-100洗脱液：0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液【操作方法】一、凝胶的处理　Sephadex G-100干粉经蒸馏水室温充分溶胀48h，或沸水浴中煮沸2h，冷却至室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。 二、装柱 关闭出口，向柱内加入洗脱液约1cm高，将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然沉降，凝胶沉降约1㎝高度后打开出水口，继续加入凝胶浆，直到凝胶沉积至一定高度即可。装柱要求连续，均与，无气泡，无“纹路”。三、平衡 将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2～3倍柱床体积的洗脱液平衡，流速为0.5ml/min。四、加样与洗脱 将柱中多余的液体放掉出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将1ml样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，加洗脱液至液层4cm左右，接上恒流泵，开始洗脱（ 0.5ml/min）。五、收集与测定 用部分收集器收集洗脱液。紫外检测仪280nm处检测，将检测信号输入色谱工作站系统，绘制洗脱曲线。六、凝胶柱的处理 凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱（2~3倍床体积）即可。注意事项各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。