胞浆蛋白核蛋白膜蛋白抽提试剂盒(真核细胞).docVIP

胞浆蛋白/核蛋白/膜蛋白抽提试剂盒(真核细胞) (Catalog #DBI-1021 ; DBI-1022; Store kit at 4℃ 描述: 本试剂盒提供了蛋白抽提试剂A，蛋白抽提抽提试剂B，蛋白抽提试剂C 三种具有独特组分的缓冲液。所有试剂采用PIPES缓冲系统。通过实验， 可以得到： 细胞胞浆蛋白（其中含有含有可溶性的骨架蛋白）； 细胞膜蛋白（其中包含细胞质膜蛋白和细胞器膜蛋白）； 细胞核蛋白； 其最后剩余的沉淀为难溶性的胞质骨架和纤维蛋白。 提取方法简单，可靠，快速。获得的各种部分蛋白纯度高，可用于PAGE 电泳、Western Blot、免疫共沉淀、EMSA等后续研究。该试剂盒所得到 的蛋白溶液适合用Bradeford法（DBI生物产品：DBI-1045,1046）蛋白定 量和BCA方法（DBI生物产品：DBI-1047,1048）进行定量。 II 试剂盒组分: III.蛋白质抽提步骤: A. 注意事项和试剂准备: ? 打开试剂盒后，于4度保存蛋白抽提液；于-20度保存蛋白酶抑制剂， 样品缓冲液（6×）。 ? 使用前, 加10ul的蛋白酶抑制剂于1ml蛋白抽提试剂A中，使成为蛋白 抽提混合试剂(该混合物被称为Extraction Buffer Mix ——A)；加 2ul的蛋白酶抑制剂于200ul蛋白抽提试剂B中，使成为蛋白抽提混合 试剂(该混合物被称为Extraction Buffer Mix ——B)；加2ul的蛋白酶 抑制剂于200ul蛋白抽提试剂C中，使成为蛋白抽提混合试剂(该混 合物被称为Extraction Buffer Mix ——C)； 试剂盒组分 DBI-1021 DBI-1022 包装 50 次100 次颜色 蛋白抽提试剂A 蛋白抽提试剂A-1 蛋白抽提试剂B 蛋白抽提试剂C 混合型蛋白酶抑制剂(100×) SDS样品缓冲液(6×) 50ml 500ul 50ml 25ml 1支 5支 100ml 1000ul 100ml 50ml 1支 10支 棕色 棕色 棕色 棕色 棕色 绿色 ? 在试验过程中确保抽提混合物始终保存在在碎冰中。 ? 需要自己提供的试剂：90% acetone，PBS 抽提所使用的蛋白抽提试剂使用量 抽提步骤 Ⅰ. 准备细胞 1. 将培养好的细胞用预冷的PBS 清洗2-3 次。 2. 选择合适的方法进行悬浮细胞和贴壁细胞的蛋白抽提： 如果样品为悬浮细胞；蛋白抽提试剂的使用量依赖于培养细胞的湿重或细 胞数量。 a) 转移悬浮细胞培养液到一个预先称重的离心管中，简单的离心。 b) 弃去上清培养基，称量其重量，计算出悬浮细胞的重量。 c) 按照实验II 进行下面的实验。 如果样品为单层贴壁细胞： 蛋白抽提试剂的使用量取决于培养细胞 的器皿大小或细胞数量。 a) 按照实验III 进行下面实验。 Ⅱ. 悬浮细胞蛋白抽提实验步骤 1. 吸取取5 倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂A ，加入到已经清洗好的细胞 沉淀中。用移液器小心吹打，使细胞悬浮。 2. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约10 分钟。使95-100%的细胞 胞浆流出细胞。 注意：在实验过程中，每个步骤的时间要保持连贯性。 3. 以480g 的离心速度，4 度离心10 分钟。 4. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为胞浆蛋白。（ 标 记为上清1）。于-70℃保存该样品。 5. 吸取取3 倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂B，加入到沉淀中。用移液器 小心吹打，使沉淀悬浮。 6. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约30 分钟。 7. 以5000g 的离心速度，4 度离心10 分钟。 8. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞质膜蛋白。 （标记为上清2）。于-70℃ 9. 吸取取1.5 倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂C，加入到沉淀中。用移液器 小心吹打，使沉淀悬浮。. 漩涡混合器上高速振荡30 秒，或转移到玻璃 匀浆器中高速匀浆30 秒。 10. 以6780g 的离心速度，4 度离心10 分钟。 11. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞核蛋白。 （标记为上清3）。于-70℃ Ⅲ. 单层贴壁细胞的蛋白抽提 对于贴壁细胞，用细胞刮将细胞刮掉，用PBS 清洗细胞3 次。600g，离 心5 分钟，收集细胞。下面实验适用于约5×106 个细胞。 1. 吸取取1ml 的蛋白抽提试剂A，加入到已经清洗好的细胞沉淀中。用移 液器小心吹打，使细胞悬浮。 2. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约10 分钟。使95-100%的细胞 胞浆流出细胞。 注意：在实验过程中，每个步骤的时间要保持连贯性。 3. 以480g 的离心速度，4 度离心10 分钟。 4. 转移上清到一个干净的离心管中。记录