2013临床PCR检测技术-实习生讲课课件.pptVIP

起点定量与终点定量 起点定量 终点定量 “加进不同拷贝的膜板” 半对数图谱 线性图谱 。 同一个样品重复96次 起点定量的优势 终点产物数量： 误差太大 拐点产物数量：重现性好 起始DNA量，更具意义 重现性好，误差小 。 起点定量的关键：CT值 CT值：荧光信号有统计学意义显著增长(穿过 阈值线)时的循环次数 CT值 半对数图谱 CT值 线性图谱 。 CT ? 起始DNA浓度 当循环次数n=CT值时： RT = RB + X0 (1+ E)CT Rs lg (RT - RB) = lg X0 + CT lg (1+ E) + lg Rs CT lg (1+ E) = - lg X0 + lg (RT - RB) – lg Rs 即 CT = - k lg X0 + b （线性方程） Rn = RB + X0 (1+ E)n Rs 。 CT值 - X0 作图 CT X0 CT = - k logX0 + b 。 四、PCR检测的临床应用 （一）标本采集要求 。 临床PCR技术 。 Kary B. MullisUSA, for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method 1930年提出了两种核酸DNA和RNA的概念 1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构及其半保留复制模型。 一、PCR概述 。 一、PCR概述 （一）PCR概念 PCR （polymerase chain reaction)是一种在体外通过重复DNA合成，以扩增特定核苷酸序列的方法。 特点 高灵敏度 高特异性 体外进行 快捷 。 PCR的概念 核心技术是从水栖高温菌中分离到能耐高温的Taq酶，使扩增反应不需要每一个循环加一次DNA聚合酶，从而实现了自动化。 应用领域迅速扩大，PCR技术成为了分子生物学中的一项突破性技术。 。 PCR概述——2000至2013年发表论文1280748篇 。 一、PCR概述 （二）原理 双链DNA 变性 退火 链延伸 （膜板） （双链分成单链） （膜板与引物杂交） （DNA合成） 不断重复 。 二、实验步骤 （一）核酸提取 1.DNA提取 100ul浓缩液 100ul血清 吹打混匀 12000g离心5min 弃上清 20ul提取液 100℃煮10min 模板 。 二、实验步骤 2.RNA提取 10ulA液 200ulB液 震荡混匀 8000g离心1min 200ulDEPC乙醇 65℃干燥 10min RNA模板 8000g离心1min 逆转录 为cDNA 弃上清 重复洗2次 50ul血清 。 3、细胞或组织 剧烈震荡 400ul试剂1 加入400ul试剂2震荡混匀 12000g离心5min 完全弃上清 加入试剂3 模板 加样扩增 杂交显色 。 （二）扩增 HBV引物(168bp)： 上游：5-GAAGTGTGACGTTGACATCC 下游：5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGG 扩增体系：（50μl体系） 10*Buffer ---5μl dNTP ---1μl MgCl2 ---3μl Primer F ---2μl Primer R ---2μl DNA ---2μl Taq酶 ---1μl H2O ---34μl 。 反应程序 预变性 94?C 3min 循环 延伸 72?C 5min。 注：每组实验阴性对照用无菌生理盐水代替模板 58?C 45 s 72?C 45 s 94?C 45 s 30循环 。 （三）结果判读 。 （四）PCR的常见问题及处理措施 常见问题 污染：表现为阴性对照同样出现目的条带或阴性对照出现‘S’形曲线。 污染的来源： 来自其他测试样品的DNA 来自试验材料如重组克隆的DNA外源DNA污染 来自同一靶序列前一次PCR的扩增产物。 。 （三）PCR的常见问题及处理措施 如何减少污染 实验室分区 。 酶法控制 尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG) 短于100bp的PCR产物不能用UNG完全消除污染。 紫外线表面照射 消除试剂、加样头中的DNA污染。 对短PCR产物效果不好 以预防污染为主 良好的实验室操作 。 三、荧光定量PCR 。 （一）荧光PCR定量的概念 以外参已知数量拷贝数的标准品为标