紫外法测定血清总蛋白.pptVIP

紫外分光光度法测定血清蛋白质 临床生化实验室 一、实验目的 掌握紫外分光光度法测定血清蛋白质的原理。 学习754型紫外分光光度计的使用方法。 二、实验原理 大多数蛋白质中酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在280nm具有一个紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，因此可作蛋白质定量分析。 二、实验原理 由于生物样品中常混有核酸，核酸中的碱基对紫外也有吸收，但其峰值在260nm附近，因此可用下列公式计算蛋白质浓度： Lowry-Kalckar公式： 蛋白质浓度（g/L）=（1.45A280-0.74A260) （A280和A260分别代表光径为1cm时蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值。） 三、实验操作 （一）实验操作步骤 1、取待测血清0.05ml（50ul）于中号试管内 2、取生理盐水4.95ml加入到此试管内，边放边震荡，轻轻混匀 3、生理盐水调零，测定波长280nm及波长260nm的吸光度值 三、实验操作 （二）紫外分光光度计的使用方法 1、接通电源，打开仪器开关，预热10min 2、调波长为260nm 3、依次把生理盐水、待测液倒入比色杯内，放入比色槽 4、推动拉杆至最前方，以生理盐水调零 6、测定待测液的值 7、调波长为280nm，重复4~6步的操作 四、结果计算 计算公式： 蛋白质浓度（g/L）=（1.45A280-0.74A260) ×100 五、方法学评价 紫外法优缺点： 优点 操作简便，可保留蛋白生物活性； 没有发生化学反应，标本可重复利用。 临床意义见双缩脲法 六、注意事项 需用石英比色杯，光径=1cm，拿法同722型比色杯，价值昂贵，用时小心 用5ml的吸量管取生理盐水时，先查看吸量管刻度是否到尖端，若到尖端，应先放掉0.05ml，再将剩下的4.95ml液体放入试管中。 六、注意事项 由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，显色深浅随不同蛋白质改变，因而本法只适用于蛋白质相对浓度的测定，核酸对结果也有影响，尽管进行了公式校正，但是不同样品干扰成分差异较大，致使280nm紫外吸收法检测的准确性较差。 * * 参考范围： 正常人：60~80g/L 五、方法学评价 紫外法优缺点： 缺点 各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同，因此测定有一定误差； 在280nm测定易受尿酸和胆红素的干扰，导致准确性和特异性受影响； 若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干扰，此时必须同时测定260和280nm吸光度，通过公式校正测定，以消除核酸的影响，而推算出蛋白质浓度。