原代细胞的培养和建系.pptVIP

第三节 原代和传代细胞的培养和维持 原代细胞的培养与维持 原代细胞培养的首次传代 传代细胞的传代培养 传代细胞的建系和维持 一、原代细胞的培养与维持 （一）原代细胞培养： 1．静置贴壁细胞（包括半贴壁细胞的培 养）培养 2．悬浮细胞的培养 静置贴壁细胞（包括半贴壁细胞）培养要求 细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性。 细胞接种时浓度要稍大一些，至少为 5×108细胞/L。 培养基可用Eagle（MEM）或DMEM。 小牛血清浓度为10%-20%。 应在37℃、5% CO2的培养箱中培养。 在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落、漂浮。 待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，应将原代细胞换液。 骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时，应将细胞悬液经低速离心后换液。 悬浮细胞的培养要求 原代培养时要尽量去除红细胞。 短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中进行。 细胞浓度可在5-8×109/L范围内。 进行分瓶试验。 长期培养时，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长。 细胞换液一般每隔3天需半量换液一次。 细胞传代一般待细胞增殖加快、细胞密度较高时才能进行。 （二）原代细胞的维持 贴壁细胞长成网状或基本单层时，未达到饱和密度，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。 换入等量完全培养基或换成含2%小牛血清的维持液。 悬浮细胞细胞培养基中不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，需进行换液。通常采用半量换液的方法。 二、原代细胞培养的首次传代 原代培养后，由于悬浮细胞增殖，数量增加甚至达饱和密度，或贴壁细胞相互汇合，使整个瓶底逐渐被细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。每进行一次分离再培养称为传一代。 首次传代应注意以下几点： （1）细胞生长密度不高时，不要急于传代。 （2）原代培养的贴壁细胞需控制消化时间。 （3）吹打已消化的细胞应减少机械损伤。 （4）首次传代时细胞接种数量要多一些。 （5）首次传代培养的pH应偏低些，小牛血清浓度可加大至15%～20%左右。 三、传代细胞的传代培养 传代细胞，可根据不同细胞采取不同的方法进行细胞传代。贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁的细胞用直接吹打或用硅胶软刮的刮除法传代。悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传代。 四、传代细胞的建系和维持 细胞系的维持通过换液传代再换液、再传代和细胞种子冻存来实现。 每一个细胞系都有其自身的特点，要做好建系和维持，必须记录好细胞档案， 及时换液传代并做好细胞系（或株）的鉴定和管理工作。 第四节 原代细胞的纯化和克隆 体外培养的细胞绝大多数呈混合生长，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步。 一、细胞的纯化 细胞的纯化分为： （一）自然纯化：长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，最后留下生长优势旺的细胞，达到细胞纯化的目的，如肿瘤突变细胞可通过此方法建立细胞系。 （二）人工纯化：利用人为手段造成对某一种细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。主要有以下5种方法： 1．细胞因子依赖纯化法：通过加入某些特殊的细胞因子而纯化出只依赖于这种细胞因子生长的细胞系。 2．酶消化法：利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，使两者分开，达到纯化的目的。另外对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离纯化也是十分有效的。?? 3．机械刮除法 原代培养时，如果上皮细胞和成纤维细胞为分区成片混杂生长，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上，可采用机械的方法去除不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域。 4．反复贴壁法 成纤维细胞贴壁过程快，能在短时间内完成附着过程，而上皮细胞在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，利用此差别可以纯化细胞。 5．电烙筛选法 贴壁细胞转化时，在培养瓶的细胞层中会出现分散的转化灶，细胞密集、排列规则，有明显生长趋势，与周边未能转化的细胞有明显的区域界限，可用机械刮除法去除或用电烙筛选法烫死未转化细胞而保留转化灶细胞。 二、细胞的克隆化 细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体中分离出一个细胞，并使其在体外培养体系中能繁殖成新的细胞群体，这种由单个细胞所形成的细胞群（或集落）称为一个克隆，这种纯化后的细胞群体称为细胞株。 主要的克隆方法有5种 （一）毛细管克隆法 （二）有限稀释克隆法 （三）