DNaseI足迹试验的流程如下.ppt

生物大分子相互作用的研究方法 三峡大学医学院 盛 德 乔 shengdq@ 世界上只有一种疾病，那就是——基因表达异常 Roger J. Williams(Nutrition Against Disease: Environmental Prevention 1971 ) 核酸和蛋白质是生物体内重要的生物活性大分子，各自有其结构特征和特定功能，是生命活动的主要组成部分。 两者的相互作用构成了诸如生长、繁殖、运动、遗传和代谢等生命活动。 HGP完成之后，大量的基因被发现和定位，基因功能的研究成为分子生物学研究的中心问题之一。 蛋白质和核酸的相互作用——参与了很多体内的生物学过程，弄清DNA-蛋白质相互作用的机制，对我们了解DNA 转录调控和基因表达机制，揭示各种生命活动现象具有极其重要的指导作用。 蛋白质和蛋白质间的相互作用——蛋白质是细胞活性及功能的最终执行者，每个蛋白质并不是独立地行使其功能，它们在细胞中通常与其他蛋白质相互作用形成大的复合体，在特定的时间和空间内完成特定的功能 。 DNA-蛋白质相互作用的研究方法 蛋白质和核酸的相互作用参与了很多体内的生物学过程，弄清DNA-蛋白质相互作用的机制，对我们了解DNA 转录调控和基因表达机制，揭示各种生命活动现象具有极其重要的指导作用。 /method/methods-detecting-protein-dna-interactions 研究DNA-蛋白质相互作用的技术有很多，包括： DNase I足迹试验 电泳迁移率变动实验(EMSA) 酵母单杂交技术 染色质免疫沉淀技术（ChIP） ChIP-Sequence技术 甲基化干扰试验 噬菌体展示技术 核酸适体技术 等等。 1. DNase I足迹试验 蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被DNase破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。 DNase I足迹试验是一种鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上结合位点的方法，它不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。足迹试验的方法较多，常用的有DNase I足迹试验和硫酸二甲酯足迹试验(dimethylsulfate，DMS)，两者原理基本相同。 DNase I足迹试验的实验流程如下： 待检双链DNA分子用32P作末端标记，通常只标记一端； 蛋白质与DNA混合，等两者结合后，加入适量的DNase I，消化DNA分子，控制酶的用量，使之达到每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键断裂，并列设置未加蛋白质的对照； 从DNA上除去蛋白质，将变性的DNA加样在测序凝胶中作电泳和放射性自显影，与对照组相比后解读出足迹部位的核苷酸序列。 2. 电泳迁移率变动实验 电泳迁移率变动实验(electrophoresis mobility shift assay , EMSA)又称凝胶阻滞实验，是一种简单、快速和灵敏的体外检测DNA 与蛋白质相互作用的技术。 验证！ 基本原理——在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了，导致在聚丙烯酰胺凝胶电泳上发生阻滞，形成滞后带。 EMSA的主要实验步骤： 探针制备(设计、合成、标记、纯化、退火) 具体实验设计 核蛋白(?)制备及浓度测定 EMSA操作 实验时竞争设计! 凝胶阻滞试验一定要排除非特异结合。其方法是在DNA-蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记的竞争DNA(competitor DNA/冷探针)。 如果它与同位素标记的探针DNA结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，所以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。 探针突变？ 抗体超迁移检测（antibody supershift assay）是在凝胶阻滞实验的基础上进一步发展而来。在DNA-蛋白质结合反应体系中加入抗目的DNA结合蛋白质的特异抗体。由于抗体的结合，使DNA-蛋白质-抗体的分子量增加，DNA-蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率进一步降低，出现“超迁移带”。 3. 酵母单杂交yeast one-hybrid system EMSA技术是一种简单和灵敏的检测DNA-蛋白质相互作用的技术，但它不能发现新的DNA-蛋白质的相互作用。（只能验证！） 酵母单杂交技术不仅能验证和检测已知的DNA-蛋白质