微生物技术讲解.ppt

食源性致病微生物是指以食物为载体， 导致人类发生疾病的一大类微生物（古菌、细菌、真菌、病毒等）。近年来，全球食品安全事件频频发生， 如美国的“李斯特氏杆菌事件”、日本的“大肠杆菌0l57流行事件”等，对人类健康带来很大危害，引起各国政府的全力关注。 传统的检测方法(如分离培养、生化鉴定等)无法对难培养或不可培养的致病微生物进行检测， 而且特异性不高、灵敏度低、操作烦琐耗时，不能实现有效的监测、预防作用。 因此，发展新的快速检测与鉴定食源性致病微生物的方法是及时有效地控制和预防致病微生物传播的前提。 ;国内外食源性致病微生物检测新技术 ;一 免疫学检测技术;1. 免疫荧光技术;2. 免疫磁性分离技术;3. 免疫胶体金技术 ;4.酶联免疫吸附检测(ELISA);应用：ELISA技术自二十世纪70年代出现开始，在临床和生物疾病诊断???控制等领域中倍受重视。特别是随着蛋白质分离纯化技术和基因工程技术的不断发展，各种高纯度抗体、抗原和抗体复合物得以制备，单克隆抗体技术的应用，使得该诊断检测技术在特异性、灵敏度和客观性方面都有了大幅度的提高，并且在自动化免疫技术的推进之下进一步具有了精确的定量分析能力。由于ELISA的技术条件要求低、适用范围宽、携带方便、且易商品化、操作简便和经济实惠，它已成为一种应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测与分析技术，常以试剂盒的形式出现 。;完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：(1)包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂)；(2)酶标记的抗原或抗体；(3)酶的底物：(4)阴性和阳性对照品(定性测定)，参考标准品和控制血清(定量测定)；(5)结合物及标本的稀释液；(6)洗涤液；(7)酶反应终止液。结合物为酶标记的抗体(或抗原)，是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物既保持了酶的催化活性，也保持了抗体(或抗原)的免疫活性。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)和碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，AP) 。国产ELISA试剂一般都用HRP制各结合物。国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶(AP)作为标记酶。; 近年来，该项技术在食品安全性检测中正逐步得以推广应用，如微生物污染、天然毒性物、人兽共患疾病病原体检测等方面的检测分析。 微生物污染：Kryinskiand Heimsch等(1977)首次将ELISA用于食品沙门氏菌(Salmonella spp．)的检测，并在应用中不断得以发展。目前有许多种方法，其中通过制备单克隆抗体分析食品中细菌的ELISA技术研究最多，检测结果准确可靠。例如对沙门氏菌最低检测量可达500CFU／g，仅需22h， 比常规方法缩短了3～4d，与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。此外以ELISA技术为基础的全自动沙门氏菌 检测系统，实现了整个过程的自动化，全程耗时仅为45min。 毒素检测：真菌毒素(mycotoxin)是真菌产生的次级代谢产物，其中的十几种对人类危害较大，它们一般同时具有毒性强和污染频率高的特点。其中毒性最大、致癌能力最强的是黄曲霉毒素(AFT)。它在自然界中分布十分广泛，黄曲霉常常和其他多种微生物在一起，生长在粮食、油料作物的种子、各种食品和饲料中。自1977年抗黄曲霉素B1的单克隆问世，至今，几乎所有重要真菌毒素(如伏马毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯酮、展青霉素等)的ELISA检测方法均已建立。 ; 人兽共患疾病病原体检测：海绵状病毒(BSE)是牛的一种致死性神经系统疾??，它与人群发生变异型克雅氏病(VCJD)有关。对于该病病原，普遍认为是由一种蛋白质性的感染颗粒也称朊蛋白，是一种病理性细胞朊蛋白(PrPSc)，由正常的细胞朊蛋白(PrPc)转变而来。蛋白酶核心位点的抗体应用于检测正常及BSE动物脑组织PrPc的含量，对于天然组织，两组差异很小，但经加热及异硫氰酸胍处理后，ELISA可将牛脑匀浆物中BSE特异性的PrPSc与PrPc区分开来，无明显临床症状的BSE感染动物可被检出，经对朊蛋白Western印迹法检测牛及羊朊病毒蛋白的灵敏度、特异性及可靠性进行分析，证明该方法是有效的。此外，在禽流感病毒检测方面，我国已完成了禽流感流行株的分离和鉴定、禽流感重组核蛋白诊断抗原的研制及应用， 建立了禽流感免疫酶诊断方法和技术， 已形成试剂盒生产能力。;ELISA技术的发展趋势 ;天然酶定向改造和体外分子进化：运用天然酶定向改造和体外分子进化手段，研究开发的免疫测定标记用酶融合蛋白(一种同时具有催化底物显色反应酶活性和特异性抗体或抗原性质的融合蛋白)可以作为结合物