PCR技术原理 变性与复性.ppt

变性与复性; DNA的变性(denaturation)：;;解链温度（融解温度，Tm）(melting temperature)：;;???色效应： DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。;DNA的复性（renaturation)：;;减色效应： 变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。;1. 常用的变性方法： ;2. 影响复性的因素 ;PCR技术总论; 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。 ; 聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。 70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki（1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶，简称Taq DNA聚合酶。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。;PCR基本原理;PCR原理;PCR product;PCR反应曲线;标准的PCR反应体系;PCR反应五要素;引物;引物设计的原则（一）;引物设计的原则（二）;引物设计的原则（三）;引物设计的原则（四）;酶及其浓度;dNTP 的质量与浓度;模板（靶基因，target gene）;模板（靶基因，target gene）;Mg2+浓度;PCR反应条件的选择;温度与时间的设置：;① 变性温度与时间：; ② 退火(复性)温度与时间：;引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：;③ 延伸温度与时间：;③ 延伸温度与时间：;循环次数;PCR反应特点;特异性强;PCR反应的特异性决定因素;灵敏度高;简便、快速;对标本的纯度要求低;热启动PCR Touch-down PCR RT-PCR 兼并引物PCR 巢氏PCR 反向PCR 不对称PCR 原位PCR 连接酶链反应 RACE-PCR AFLP 免疫-PCR(immuno-PCR) MSP甲基化特异PCR;1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针； 基因组DNA结构功能的研究; ;2)反向PCR (reverse PCR) ;已知序列;3）多重PCR（复合PCR）;电泳;4）LP-PCR（Labelled primers);标记引物;5）锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）;cDNA;6）PCR固相分析法;7）原位ＰＣＲ;操作步骤 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物;8）ＲＴ－ＰＣＲ;9) 荧光定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 ;5’; 实时荧光定量PCR仪;什么是测序？;Sanger第一步：加入复制终止剂;Sanger第二步：荧光检测;Shotgun测序;DNA整体;Shotgun测序（2）——;拼接错误：Repeat的存在;基因的概念; 经典遗传学中基因的概念 孟德尔称控制性状的因子为遗传因子 1909年约翰生提出了基因这个名词，取代孟德尔的遗传因子 →摩尔根等人对果蝇、玉米等的大量遗传研究，建立了以基因和染色体为主体的经典遗传学 经典遗传学认为：基因是遗传上最小的结构与功能单位，不能分割。是结构与功能的统一体; 分子遗传学中基因的概念 基因的本质： （1）基因是特定长度和碱基序列的DNA片段 （2）核苷酸序列中蕴藏着遗传信息： mRNA 多肽