ELISA结果影响因素.ppt

 实验室环境也是保证结果可靠的因素之一， 应做好以下控制： 通风、采光与防尘； 控制温度及湿度，环境温度与湿度随地理位置不同可有很大差异应使用系统空调进行控温，并要求控制空气湿度为 40%-70%之间； 消除噪音与电磁干扰； 稳定水电，实验过程中应采用蒸馏水 （ 纯水）或经软化处理的自来水。 结果影响因素——环境因素 综上所述，ELISA检测结果是受多方面因素影响的，我们应该提高个人工作责任心，提高质量控制意识，在工作中总结经验，尽量避免或减少人为干扰因素对结果的影响。 * * * 最常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。 * * 手工和洗板机洗板。采用手工洗板，孔与孔之间液体易交叉，采用半自动洗板机时，洗液量不足导致洗板不彻底，洗板针堵塞导致抽吸不完全，洗板不畅导致清洗效果差。 洗液冲力过大会造成酶结合物丢失，本底偏浅，吸光度值偏低，且洗板后残留液规定一般不超过,! * * ELISA测定结果影响因素 * 主要内容 一、 ELISA简介 二、ELISA试验结果影响因素 ELISA简介 ELISA(?EnzymeLinked?Immunosorbnent?Assay?)是酶联接免疫吸附测定的简称。是一种免疫学测定方法，主要通过抗原抗体反应检测液体标本中目的蛋白性质、功能及含量。 ELISA实验原理 抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性并能相互特异性结合。 抗原抗体复合物与酶标二抗结合， 加入合适的底物，在酶的作用下显色， 颜色深浅与特异性抗体成比例关系， 可进行定性和定量分析。 抗原抗体反应的特异性 + 酶高效催化反应的专一性 ELISA检测方法 抗原测定方法 抗体测定方法 双抗体夹心法 竞争法 双抗原夹心法 竞争法 间接法 主要操作流程 + 已知抗体 包被于载体表面 加待检物 无抗原与抗体结合 - E E E E E E E E E 已知抗体 包被于载体表面 加待检物 抗原与抗体结合 加酶标抗体 与抗原结合 加酶作用的底物 产生颜色 加酶标抗体 与抗原结合 加酶作用的底物 不产生颜色 双抗体夹心法测抗原 ELISA结果判定 1.定性测定? (1)肉眼观察：比较检测孔与对照孔的颜色。 (2)阳性判定值法(cut-off value，CO值)：一般为阴性对照的平均A值加一个常数，标本A值≥CO值即为阳性。 (3)抑制率法：在竞争抑制法中结果可用抑制率表示。 抑制率(％)＝(阴性对照A- 待测A)／阴性对照AX100％,一般以抑制率≥50％为阳性 2.半定量测定 ?结果一般以滴度表示。将标本连续稀释后，进行ELISA检测，在阳性临界值以上的最高稀释度即为该标本的“滴度”。 3.定量测定 ?用己知量的标准品作一系列稀释后进行ELISA测定，与待测标本同时进行测定，绘制标准曲线，结果以绝对量或活性单位表示。? ELISA结果判定 结果判定方法的选择： 间接法和夹心法ELSIA （阳性孔呈色深于阴性孔 ) 竞争法ELISA （阳性孔呈色浅于阴性孔） 1.定性结果可以用肉眼判定 2.阳性判定值 3.标本/阴性对照比值? 1.阳性判定值法 2. 抑制率法 3.不可用肉眼判断 结果影响因素 ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时会出现一些错误结果。引起错误结果的原因主要有：1、标本因素 2、试剂因素 3、操作因素 4、环境因素。 结果影响因素——标本因素 内源性物质 类风湿因子 补 体 嗜异性抗体 自身抗体 医源性诱导的抗体 交叉反应物 外源性物质 标本溶血 标本污染 贮存过久 凝集不全 采血管中添加物 标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种。 结果影响因素——标本因素 内源性物质： （1）类风湿因子? 与ELISA系统中的捕捉抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，导致假阳性结果。?解决办法是：①用F(ab)2替代完整的IgG；②标本用联有热变性（63℃，10?min）IgG的固相吸附剂处理（将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效）；③检测抗原时，可以用2-巯基乙醇等加入到标本?稀释液中，使RF降解。 （2）补体 ? ELISA系统中固相一抗和标记二抗过程中，抗体分子发生变构，其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来，使C1q?可以将二者连接起来，从而造成假阳性。解决的办法是：①用EDTA稀