山东大学研究生国家_克隆载体.ppt

基因工程的克隆载体 Genetic Cloning Vector 基因工程的目的 基因克隆-----获得目的基因 基因表达-----使受体的新性状表现，获得大量目的蛋白 In vivo expression In vitro expression 载体---基因工程中的重要工具 载体(vector)：携带外源DNA进入宿主细胞的工具 载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件 载体的两种扩增方式---自主复制型载体和附加载体 克隆载体（cloning vector) 定义(definition) 特点(features) 常用载体介绍(several vectors) 第一节 概述introduction 一、概念 克隆载体（cloning vector)：用于携带目的基因（外源基因）进入受体细胞进行复制、扩增的工具。 二、特点(vectors which are used in genetic engineering should:) 1、能独立复制，具有复制子（replican) ＊replican：基因组中能独立复制的最小单位，含复制起始点(ori)和复制终点。 ＊ DNA的复制由ori控制 ＊原核细胞的染色体和质粒有固定的ori ＊真核细胞的染色体有多个ori 复制起点种类与拷贝数间的关系 ?1) 质粒复制起点类型： 低拷贝（严紧型，1-2 copies，受宿主染色体基因控制） 高拷贝（松弛型，20 copies，受宿主染色体控制较弱） 2) ARS型载体：拷贝数较高（约20 copies） 3) 病毒型复制起点：高拷贝 2、属于松弛型复制子(relaxed plasmid) 3、具有复制非必需区 4、有一个或多个单一酶切位点，即多克隆位点 多克隆位点（Multiple cloning site,MCS）：一段人工合成的DNA序列，其上含有密集排列的多种单一限制性内切酶位点，以利于不同来源的外源DNA插入载体。 5、具有筛选标记 6、分子量合适（3-10kb) 7、高拷贝数 拷贝数（copy):一个细胞内存在的 分子数 8、生物安全性好 三、 克隆载体必备条件  四、常用克隆载体种类 Classification of cloning vectors) 质粒（plasmid) ?噬菌体（bacteriophage ?) 粘粒（cosmid） M13噬菌体（bateriophage M13） 人工染色体(artificial chromosome) 第二节 常用克隆载体介绍 Several cloning vectors 一、质粒（plasmid) （一） 一般特性(features) Plasmid：染色体外能够进行自主复制的遗传单位。 包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体 多为环状双链DNA 可自我独立复制 天然存在：F质粒、R质粒等 编码重要遗传信息 不相容性 （二）分类(classification) ?大小：小型质粒(?15kb ) 大型质粒(?60kb) ?功能：F质粒、R质粒 ?宿主：窄宿主范围质粒：ori特异，仅能在一种宿主中复制 宽宿主范围质粒：ori不特异，可在多种宿主中复制 ?复制类型： 严紧型质粒： 复制受宿主细胞的严格控制 低拷贝数（1-2copies/cell) 松弛型质粒： 拷贝数高(10-200 copies/cell) 复制仅需DNA聚合酶I，不需蛋白质合成 宿主细胞蛋白质合成及染色体复制停止时，可大量扩增至上千份（氯霉素） ?构型： 超螺旋型（supercoiled circle,SC) or 共价闭环双股DNA( covalently closed circle,CCC) 开环型（opened circle,OC） 线形（linear circle,LC) （三）质粒的命名 用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。 如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。 （四）克隆质粒的改建(how can cloning vectors be made) 1、改建质粒的目的 调整质粒结构、提高转化率 2、常用手