实验二淀粉酶活性的测定.pptVIP

生物化学实验 * 生物化学实验 Please be quiet, 上课了！！ * 生物化学实验 淀粉酶活性的测定 实 验 二 学时：3 * 生物化学实验 1、学习并掌握植物体内淀粉酶活性测定 的原理和方法。 2、掌握α，β-两种淀粉酶的理化特性。 一、实验目的： * 生物化学实验 二、实验原理: 淀粉是植物生长期间以淀粉粒形式存在于细胞的储存多糖。种子、块茎、块根器官含量丰富。 天然淀粉含两种组分：直链和支链淀粉。多数淀粉含直链与支链淀粉的比例(20％－25％)：(75％－80％)。 NRE RE 直链淀粉 直链淀粉的螺旋结构 0.8nm 1.4nm 6个残基 RE NRE ?(1-6)分支点 支链淀粉或糖原分子示意图 支链淀粉或糖原分支点的结构 β-淀粉酶断裂 产生游离麦芽糖 * 生物化学实验 酶（enzyme） 是具有高效性与专一性的生物催化剂（biological catalyst）。 绝大多数酶的化学本质是蛋白质。 特点： 1、酶具有高效性（high catalytic power） 2、酶具有专一性（specifity） * 生物化学实验 酶活性（emzyme activity） 指酶催化特定化学反应的能力，其大小可用一定条件下酶促反应速度来表示，酶促反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。 * 生物化学实验 淀粉酶能催化淀粉水解为麦芽糖。植物中淀粉酶有两种，各有其不同的理化特性。 α-淀粉酶耐热不耐酸，70℃加热15min仍保持其活性,pH＜3.6时钝化；而β-淀粉酶耐酸不耐热，70℃加热15min则钝化。据此钝化其中之一，即可测出另一种酶的活性。 * 生物化学实验 本实验采用加热法钝化β-淀粉酶，测定α-淀粉酶的活性。具体方法是利用3,5-二硝基水杨酸比色法来测定淀粉酶水解生成的麦芽糖的含量，以单位时间淀粉酶分解生成麦芽糖的量来表示淀粉酶活性的大小。 * 生物化学实验 在碱性，加热条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS) 反应，还原糖被氧化成糖酸， DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色,A540) 3,5-二硝基水杨酸 (DNS) * 生物化学实验 1、实验材料：萌发的小麦种子 2、仪器：(1) 可见分光光度计 (2) 恒温水浴锅 (3) 离心机 (4) 刻度试管 3、试剂：(1) 0.4M NaOH； (2)1%淀粉； (3) 3,5-二硝基水杨酸； (4)麦芽糖标准溶液(1mg/ml) (5)0.1M pH = 5.6的柠檬酸缓冲液。 三、实验材料、仪器和试剂： * 生物化学实验 四、实验步骤 1. 麦芽糖标准曲线的制作 取5支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂： 表1 麦芽糖标准曲线制作 试 剂 管 号 1 2 3 4 5 麦芽糖标准液（mL） 0 0.5 1.0 1.5 2.0 蒸馏水（mL） 2.0 1.5 1.0 0.5 0 麦芽糖含量（mg/ml） 0 0.25 0.5 0.75 1.0 3,5-二硝基水杨酸（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 沸水浴5min，流水冷却，蒸馏水定容至20ml， 摇匀，测定540nm处吸光度 吸光度值 0 * 生物化学实验 以1号管作为空白调零点，在540 nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖浓度（mg/ml）为横坐标，A540nm为纵坐标，绘制标准曲线（通过Excel线性回归曲线和回归方程）。 * 生物化学实验 2、酶液的制备 ： 称取1.0 g(记录实际质量)萌发的小麦种子 →于研钵中，加2ml水及少许石英砂，研成匀浆→转入离