westernblot实验技术和常见问题探讨_珍藏版.pptVIP

① HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存；②?AKP标记二抗用AP显色，在10mlAKP缓冲液中加入66micro；lNBT溶液和33micro； lBCIP溶液混匀，室温下将膜放入显色（37℃可加速反应）5-15min。对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。 ③底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（荧光在一段时间后会越来越弱，要控制好时间） 除了酶连二抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，比如：荧光素异硫氰酸盐标记的二抗（可通过紫外灯产生荧光）；生物素结合的二抗等等。 通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离，适 用于任何化学发光底物系统。 酸解吸 原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位点 失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化 学发光底物系统。 膜解吸方法（膜的重复利用） 膜的重复利用  如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。