质粒DNA的提取、定量、酶切鉴定与PCR实验报告.docVIP

Word格式 完美整理 生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 质粒DNA的提取、定量、酶切鉴定与PCR 实验日期 实验地点 合作者 指导老师 评分 FORMTEXT XX 教师签名 FORMTEXT 李某某 批改日期 20 FORMTEXT 13-06-03 格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。 实验目的 1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法 2、掌握碱裂解法提取质粒的方法 3、了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理和测定方法 4、 了解质粒酶切鉴定原理 5、学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的构型、分子量的大小 实验原理 1、PCR： 在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为： （1）变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 （2）退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35~70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。 （3）延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2、质粒DNA的提取： （1）碱裂解法： 1）基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： 2）高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性； 3）当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 （2）离心层析柱： 1）硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质； 2）通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； 3）低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 3、质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）： 1）物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性。 2）各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。 3）A260/A280比值可以反应DNA的纯度。 4、质粒DNA的酶切鉴定： 限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。 5、琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系). 三、材料与方法：以流程图示意 （一）材料： 1、PCR: 仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管 材料：菌液：(大肠杆菌DH5a菌株，含靶基因CHD5片段的pMD19-T)、无菌去离子水、2×Premix Taq、引物 2、质粒DNA的提取 仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅 材料：含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α? 试剂： 溶液S1、溶液S2、溶液 S3、去蛋白液W1、漂洗液W2、洗脱液Eluent 3、质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法） 仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪 材料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ 4、质粒DNA的酶切鉴定 仪器：1.5ml的EP管、微量加样枪 材料：无菌水、10×M酶切缓冲液Buf R、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul) 5、琼脂糖凝胶电泳 仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统 材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液 方法： 1、PCR SHAPE SHAPE 取0.2 ml PCR反应管一只用微量加样枪加入灭菌去离子水6.0μl?6?l?12? 取0.2 ml PCR反应管一只 用微量加样枪加入灭菌去离子水6.0μl ?6