实验3植物染色体标本制备及核型分析辅助资料.docVIP

实验3、植物染色体标本制备及核型分析 目前，国内外常用的植物染色体制片技术可以分为两种，即压片技术和去壁低渗技术。Belling(1921)提出植物染色体压片技术后，压片已成为植物染色体研究中最广泛应用的常规技术；但是由于植物细胞有坚实的细胞壁，染色体很难象动物染色体那样平整地贴在载玻片上，Omura 和Kurata(1978)把植物原生质体技术应用到水稻染色体研究之中，用纤维素酶、果胶酶和0.075mol.L-1氯化钾处理取得了一定的进展，陈瑞阳等人（1979、1982）提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗技术，并在多种植物上得到广泛应用，成为当今植物染色体研究中的重要方法。压片技术和去壁低渗技术在取材和预处理要求及其操作都是相同的，即两者的材料基础条件是相同的，但它们所采用的染色体分散方法是不同的。压片法是以人工外加机械压力使染色体分散，而去壁低渗法是用酶分解细胞壁，低渗液使细胞膜吸胀、水表面张力使染色体分开。两种技术各有其优缺点，前者操作快速简便、省材省时，后者染色体易于展开、且真实不变形，尤其是对成熟细胞多的植物组织，如芽、愈伤组织等材料有独到效果，本实验主要介绍去壁低渗染色体制片技术。 一、实验目的 1、掌握植物根尖、茎尖及叶片去壁低渗染色体制片技术，通过3周开放性实验教学，进行植物染色体制片技能训练； 2、掌握植物染色体显微照象技术及组型分析技术，通过大量的制片观察，能获得图象清晰、完整、高度分散的染色体典型制片；通过显微摄影，获得某植物染色体自然核型图，并能用国内外通用的植物核型分析标准，确定该植物染色体模型图、核式公式及类型； 3、掌握植物有丝分裂制片技术，通过大量的制片观察，能比较快速准确地判断细胞有丝分裂前、中、后、末期的染色体图象，并对其典型制片照像，收集核型分析及有丝分裂过程观察的染色体制片素材； 4、结合实验，对某一新资源植物进行染色体组型分析，获得该物种染色体组型公式、类型、核型图及核型模式图。 二、实验内容 1、植物染色体制片技术训练，独立完成植物根尖、茎尖及幼叶的取材、预处理、低渗、酶解、固定、制片、染色等去壁低渗染色体制片全过程，并获得图象清晰、完整、高度分散的染色体典型图象制片； 2、染色体显微照相技术训练，用生物摄影显微镜，摄制某新资源植物种典型的染色体图象照片40张，并从中挑选确定，被用于核型分析的染色体自然核型图5张； 3、植物染色体核型分析技术训练，用国内外植物染色体核型分析标准，确定该新资源植物种的染色体组型公式、类型、核型图及核型模式图；进行该新资源植物种染色体核型分析，力争能将该新资源植物实验结果，撰写成一篇研究小论文，或一篇能发表的研究论文； 4、细胞有丝分裂典型时期识别技能训练，通过大量的染色体图象观察，能比较快速准确地判断细胞有丝分裂前、中、后、末各个时期的。 三、实验材料 1、蚕豆根尖，2n=2x=12; 2、某新资源植物茎尖、幼叶或子房，如显齿蛇葡萄、泥蒿、鱼腥草等有开发潜力的新资源植物种的茎尖、幼叶或子房。 四、实验器材 1、设备：普通生物显微镜、NIKON数码摄影显微镜、NIKON数码相机、计算机图象处理系统、培养箱、恒温水浴锅、喷墨彩色打印机等； 2、用具：载玻片、盖玻片、眼科镊子、不锈钢剪刀、单面刀片、磨口三角瓶、移液管、试剂瓶、凹型孔白瓷板、玻璃板、烧杯、天平、电炉、染色缸、扩大镜、游标卡尺、滤纸片、玻片标签纸等； 3、药品：8－羟基喹啉、秋水仙素、氯化钾、甲醇、冰乙酸、纤维素酶、果胶酶、对二氯苯、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氢氧化钡、甘油、盐酸、胰蛋白酶、尿素、氯化钙、EDTA、Giemsa、洋红、地衣红、卡宝品红、锡夫（Schiff）试剂。 附试剂配制 ⑴0.002mol.L-1 8－羟基喹啉配制：取8-羟基喹啉0.29g，先用少许乙醇溶解，用鲜蒸馏水定溶1000ml。 ⑵0.01%秋水仙素配制：称取1g秋水仙素，用少许乙醇溶解后，用鲜蒸馏水定溶至100ml。 ⑶饱和对二氯苯溶液配制：鲜配鲜用，称取5g对二氯苯结晶，用40-45℃蒸馏水100mL溶解，振摇5min，静置1 h，取上清液，10-20 ⑷0.075mol.L-1KCL溶液配制：称KCL 5.592g，加少许鲜蒸馏水溶解后，定溶至1000ml。 ⑸2.5%混合酶配制：常用浓度2.5%，取纤维素酶、果胶酶各1g，分别溶于20mL蒸馏水中，配成5%的纤维素酶及果胶酶，再等量混合，配成2.5%浓度混合酶，溶后用0.1 mol.L-1 盐酸或0.1 mol.L-1 NAOH调pH值为5.5左右，鲜配鲜用或棕色瓶4℃ ⑹2XSSC溶液配制：2XSSC溶液即0.3 mol.L-1 氯化钠与0.03 mol.L-1 柠檬酸钠Na3C6H5O7溶液。称氯化钠17.53g, Na3C6H5O7