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第十二章 荧光分析法 fluorometry 概 述 某些物质受到光照射时，除吸收某种波长的光之外还会发射出比原来所吸收的光的波长更长的光，这种现象称为光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。 荧光的分类 根据物质是分子还是原子：分子荧光 原子荧光 根据照射光的种类：紫外荧光 X射线荧光 红外荧光 第一节 基本原理 一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 1．分子的电子能级与激发过程 荧光与磷光产生示意图 2.荧光和磷光产生 振动弛豫 vibrational relexation 内部能量转换 internal conversion 荧光发射 fluorometry 外部能量转换 external conversion 体系间跨越 intersystem crossing 磷光的产生 （二）激发光谱与发射光谱 溶液荧光光谱通常具有如下特征 Stokes shift 荧光光谱的形状与激发波长无关 荧光光谱与激发光谱的镜像关系 斯托克斯位移 荧光光谱的形状与激发波长无关 不管分子激发到s1还是s2，荧光的发生总是从s1开始，荧光光谱的形状是一样的。 蒽的激发光谱和发射光谱 二、荧光与分子结构 （一）荧光寿命和荧光效率 fluorescence lift time，?f Ft=F0e-Kt 当t=?f 时，Ft=（1/e）F0 （ 1/e）F0 = F0e-K? f 即（1/e）= e-K? f K?f= 1 K = 1/?f 求荧光寿命 fluorescence efficiency(fluorescence quantum yield) （二）有机化合物分子结构与荧光的关系 长共轭结构 分子的刚性 取代基 1. 长共轭结构 对于芳香族化合物，共轭越长， ? ex和?em都长移，荧光效率也提高。 2. 分子的刚性 同样具有???*跃迁的长共轭分子中，刚性和共平面性越大， ? 越大， ?长移。 刚性和共平面性增加 ?电子的共轭程度增加 原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉 取代基的影响 供电子基团 -NH2、-OH、-OCH3 吸电子基团-COOH、-NO2、 -NHCOCH3 -R、-SO3H、-NH3+ （三）荧光试剂 荧光胺 Dansyl-Cl 邻苯二甲醛(OPA) 测定无机离子的荧光试剂 荧光胺与脂肪族或芳香族伯胺反应 Dansyl-Cl 与伯仲胺及酚羟基反应 邻苯二甲醛(OPA)与伯胺反应 无机离子一般本身没有荧光，但与一些有机试剂生成配合物后，可产生强烈荧光 有些无机阴离子可使荧光熄灭 三、影响荧光强度的外部因素 极性溶剂使K带吸收长移，跃迁几率增大，荧光波长长移，强度增加。 溶剂粘度降低，荧光强度减弱。 ? pH值的影响 ? 荧光熄灭剂的影响 荧光熄灭剂quenching medium ?散射光的干扰 scattering light 硫酸奎宁在不同?ex的荧光与散射光谱 在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长 第三节 定量分析方法 一、荧光强度与物质浓度的关系 F= K’I0(1-10-ECL) = K’I0(1-e-2.3ECL) e-2.3ECL= 1+ F=2.3K’I0ECl=KC ECl≤0.05 F ? C ECl 0.05 F 与C不成正比 荧光法 紫外法 二、定量分析方法 标准曲线法 比例法 多组分分析 比例法（对比法） 若在某浓度范围中成线性，可用比例法测定 多组分分析 各组分荧光峰不重叠，可分别测定 相互重叠，可利用荧光强度的加和性，如： 第四节 仪器与荧光分析新技术 仪器的校正 灵敏度 波长 激发光谱和荧光光谱 荧光分析新技术简介 1. 激光荧光分析 以激光作光源，谱线更纯、强度更大。 可提高灵敏度和专一性。一次测量所需样品液 1?g，可测至10-14~ 10-16g。 2. 时间分辨荧光 time-resolved fluorometry 3. 同步荧光分析 synchronous fluorometry 荧光黄、罗丹明6G、罗丹明B混合物的同步荧光光谱（ ?? =3nm） 4. 胶束增敏荧光 F nm 320 448 350 448 360 400 ?ex 3