PCR技术及其医学应用(精).pptxVIP

PCR技术及其医学应用;;第一节 PCR原理与特点;Denaturation （变性）: The target DNA (template) is separated into two stands by heating to 95℃ Primer annealing （引物退火）: The temperature is reduced to around 55℃ to allow the primers to anneal. Polymerization (elongation, extension): The temperature is increased to 72℃ for optimal polymerization step which uses up dNTPs and required Mg++;How PCR works;2.单链DNA模板与引物退火(annealing) The primers are annealed to the single stranded DNA by cooling the sample. 通常需要两个寡核苷酸作DNA合成的引物(primer)，这两个引物分别与待扩增顺序两侧的模板DNA互补，在降低温度的过程中，通过控制退火条件， 引物就能准确地配对在扩增区域的两侧。 ;Primers 引物;3.引物的延伸(extension) The primers are extended in the presence of DNA polymerase and deoxyribonucleoside triphosphates, and complementary copies of the target DNA is produced PCR 在PCR反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中游离的单核苷酸(dNTP)按引物5-3方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的半保留复制链，新合成的链又作为下轮循环反应的模板。;Enzymes for PCR; The cycle is then repeated 以上“变性、退火、延伸”三步曲，被确定为PCR的一轮循环，整个PCR过程一般只需30个循环.;;; 尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA 顺序的指数扩增并不是一个无限制的过程。通常在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现“平台效应”，产物的量不再增加。“平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能，模板DNA的拷贝数，底物dNTP浓度及多种因素。 ;;2.高度的特异性 PCR扩增的特异性依赖于两个引物设计的特异性， 依赖于引物与模板结合的正确性。PCR反应时退火的温度对特异性也有影响. 在PCR实验中，只要引物设计合理，反应温度适宜，采用高温启动法PCR 扩增的特异性是相当高的。 ; 3.操作简便、快速 4.适用样品的广泛性 既可是DNA，也可是RNA；既可是纯化的，又可是粗制的；既可是新鲜组织，也可是陈旧样品；既可是细胞(刮片细胞、培养细胞、血细胞），又可是体液（大小便、血清、淋巴液等）；既可是完整的大分子，也可是部分降解的DNA。;第二节 PCR系统的组成及PCR最适条件;一、耐热DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶引入PCR后，使其操作大大简化。 ;TaqDNA聚合酶的特性： 以DNA为模板，从结合在特定DNA模板上的引物为出发点， 将４种脱氧核苷酸以碱基配对方式，按引物5‘-3’的方向，合成新的DNA链；有逆转录活性，， 而无Klenow 酶所具有的3‘-5’外切酶活性；可在新合成双链产物的末端加上一个非模板依赖的碱基， 且优先聚合A，利用这种特性可以构建dT-载体来克隆带dA尾的PCR产物。 ;因TaqDNA酶没有3-5外切酶活性，故无校正功能，错误频率为0.25％，即在25轮循环后，其扩增产物的顺序中400个碱基可能出现一个篡改（错误掺入）碱基。;二、寡核苷酸引物 PCR requires the synthesis of oligonucleotide primers complementary to the target DNA. The entire sequence of the target DNA does not need to be known, only the flanking regions. 就整个PCR扩增技术而言，引物的设计占有十分重要的地位， 它的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。