race原理及应用.docVIP

RACE的简介 ? 　　目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长 cDNA提供了一个便捷的途径。 　　cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。? 第二 RACE的原理 ? 　　RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。 3’RACE的原理 　　一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA； 　　二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。 　　三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。 5’RACE的原理 　　5’RACE与3’ RACE略有不同。首先，引物多设计了一个用于逆转录的基因特异引物GSP-RT；其次，在酶促反应中增加了逆转录和加尾步骤，即先用GSP-RT逆转录 mRNA获得第一链(-)cDNA后， 用脱氧核糖核酸末端转移酶和dATP在cDNA5’ 端加poly(A)尾，再用锚定引物合成第二链(+)cDNA,接下来与3’ RACE过程相同。用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物(5amp)进行PCR扩增。 全长cDNA的获得 　　通过RACE方法获得的双链cDNA可用限制性内切酶酶切和southem 印迹分析并克隆。通常的克隆方法是同时使用一个切点位于接头序列上的限制性内切酶和一个切点位于扩增区域内的内切酶。由于大多数非特异性扩增的cDNA产物不能被后一个限制性内切酶酶切，因而也就不会被克隆．从而增加了克隆的选择效率。还可以用在基因特异性引物的 5’端掺人一个限制性内切酶的酶切位点的方法来克隆。最后，从两个有相互重叠序列的3’和5’RACE产物中获得全长cDNA。或者通过分析RACE产物的3’和5’端序列，合成相应引物来扩增mRNA的反转录产物，从而获得全长cDNA。 ? 第三 RACE的应用 ? 　　RACE技术主要是应用于对全长cDNA序列的获得，但对该技术进行一定的修改后，也可在其它方面显示出极高的应用价值。 　　首先，RACE技术可用于cDNA文库的构建及筛选。Belyavaasky等(1989)用10个骨髓瘤细胞分离的总RNA，通过TdT加同聚尾、(dT)16引物反转录，接着用(dC)13和锚定引物扩增的方法建立了一个106克隆的cDNA 文库。同时，用该方法构建文库的优点是它们都只需要很少量的实验材料。建喜等(2001)利用RACE技术从已经构建的cDNA 文库中成功克隆了家兔精子膜蛋白基因。 　　其次，应用RACE克隆已知片段的旁侧内部序列(neighboring internal sequence)。Fritz等(1991)以及Struck等(1994)分别用该法获得了3’端和5’端的旁侧序列。Zhang (1996)应用LA-PCR方法获得了特异基因的5’末端非编码和编码序列,省去了构建及筛选基因组文库的麻烦。王东等(2003)利用RT-PCR和 RACE技术从玉米中获得一个长度为2469bp F2KP蛋白基因的cDNA克隆。此外，RACE技术还可用于克隆同源基因的同源片断，为寻找同基因提供了一种方法。 　　除此之外,Whitcomb等设计的随机引物/锚定PCR能对克隆质粒载体上的靶序列进行定点删除，采用(N)10锚随机引物和变性的质粒DNA进行杂交,然后通过T7聚合