《有机酸发酵》微生物过量合成丙酮酸及代谢网络分析.pptVIP

1 研究背景 为什么要研究发酵法生产丙酮酸? ? 丙酮酸的化学法生产工艺 酒石酸脱水脱羧法目前用的主要生产方法：将酒石酸与硫酸氢钾混合物在220 ℃下蒸馏，馏出物再经真空精馏即可得到丙酮酸。 其主要缺点是∶ (1) 丙酮酸产率较低(对酒石酸质量产率为0.29～0.30 g/g)； (2)得到1 g丙酮酸需要消耗5 g硫酸氢钾 以目前酒石酸(1.5 万元/t)和硫酸氢钾(0.6 万元/t)的市场价格计算，仅原料成本就至少需要8 万元/t导致丙酮酸的价格居高不下。 ? 丙酮酸的发酵法生产 发酵法生产丙酮酸在成本上具有明显优势。 ? 国外研究水平 酵母直接发酵法生产丙酮酸 酵母直接发酵法生产丙酮酸 分阶段供氧控制模式下的发酵过程曲线 ■ Glucose □ Pyruvate ▲ Biomass 1— DOT 2— Ethanol 分阶段供氧控制模式下的碳平衡 恒定kLa发酵过程中不同阶段的碳平衡 分阶段供氧控制模式，实现了高产量(69.4 g/L)、高产率(0.636 g/g)和高葡萄糖消耗速度(1.95 g/(L?h))的相对统一。 分阶段供氧控制模式∶小结 生产强度(1.24 g/(L?h))比kLa恒定为450、300和200 h-1的分批发酵过程分别提高了36%、23%和31%。 意义∶可以用于指导放大过程。 供氧良好状态下(DOT50%)，细胞产丙酮酸性能出现的差异，可能是由于: 培养基中维生素浓度处于亚适量水平时，酵解途径产生的NADH去路不同，导致细胞处于不同的能量水平而引起的。 营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响 维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用 丙酮酸分批发酵的供氧控制模式 光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征 ? 丙酮酸发酵过程的代谢网络分析 本课题的主要研究内容 维生素和溶氧对丙酮酸发酵的影响非常大 如何解释维生素限量的情况下，不同DOT( 50 %)下丙酮酸合成性能的差异? 代谢通量分析方法(MFA)提供了一个很好的手段 利用代谢网络分析可以揭示丙酮酸发酵过程的本质 为什么要进行代谢网络分析? 本部分主要研究内容 代谢网络的构建 不同维生素和溶氧水平对WSH-IP303发酵生产丙酮酸的影响 基于代谢通量分析，探讨不同营养条件下丙酮酸发酵的生理学本质 本部分主要研究内容 代谢网络的构建 不同维生素和溶氧水平对WSH-IP303发酵生产丙酮酸的影响 基于代谢通量分析，探讨不同营养条件下丙酮酸发酵的生理学本质 为什么要把维生素和溶氧结合起来研究? 在维生素限量供给、供氧充分(DOT 50 %)的条件下，细胞生产丙酮酸的性能对溶氧的变化非常敏感。 这种敏感是菌株自身特性引起的?还是由于维生素限量供给引起的? 因此，要研究维生素限量或不限量情况下，溶氧对丙酮酸发酵的影响。 A: B1= 0.03 mg/L B: B1= 0.015 mg/L ■ glucose ● pyruvate □ biomass △ ethanol ○ glycerol 不同维生素和溶氧水平下发酵过程碳平衡 本部分主要研究内容 代谢网络的构建 不同维生素和溶氧水平对WSH-IP303发酵生产丙酮酸的影响 基于代谢通量分析，探讨不同营养条件下丙酮酸发酵的生理学本质 不同维生素和溶氧水平下胞内代谢通量分配 不同培养条件下NADPH的产生与消耗 细胞能够自动调节NADPH产生途径的比例，以满足生物合成对NADPH的需求 不同培养条件下NADH的产生与消耗 硫胺素为0.03 mg/L时，随着溶氧的下降，NADH通过呼吸链氧化的比例降低，多余部分NADH通过形成乙醇得以氧化。 NADH的去路影响丙酮酸的产率 硫胺素为0.015 mg/L时，随着溶氧的下降，由于乙醇脱氢酶活性受限，细胞启动甘油途径完成NADH的再生。 高溶氧下能够获得相对较高的丙酮酸产率，因为大部分NADH通过呼吸链氧化。 溶氧水平越高越好? 对于丙酮酸发酵而言 由于NADH的氧化方式与ATP的获得直接相关，因此，还必须对ATP的影响进行深入分析。 不同培养条件下ATP的产生与消耗 硫胺素为0.015 mg/L时，随着溶氧的下降，由于甘油途径启动，细胞表观能量水平下降，葡萄糖消耗速度随之加快。 细胞表观能量水平及ATP周转速度影响葡萄糖的消耗速度 硫胺素为0.03 mg/L时，不同溶氧下(50%)细胞的表观能量水平很高，但由于胞内ATP周转速度较快，因此，葡萄糖消耗速度也较高。 降低细胞的表观能量水平。 如何加快葡萄糖的消耗速度? 加快胞内ATP的周转速度。 细胞量多，胞内ATP的周转速度快，葡萄糖消耗速度快，但丙酮酸产率必然下降； 实际研究中的矛盾 细胞量少，胞内ATP的周转速度慢，丙酮酸产率虽然很高，但葡萄糖消耗速度下降。 如何获