朱记平开题报告.pptVIP

RAS对禽流感病毒增殖的影响及流感病毒NS1基因eIF4GI结合区缺失株对病毒增殖及细胞因子影响的研究 专 业：预防兽医 研究生：朱 记 平 导 师：金梅林教授 研究目的 研究背景 实验方案 实验内容 * * 开 题 报 告 RAS蛋白对禽流感病毒在细胞内增殖的影响 一、研究背景 二、研究目的 三、研究内容 四、技术路线 五、工作进展 一、研究背景 （一）RAS家族 （二）RAS与病毒的潜在关系 （一）RAS家族 RAS家族属于常见的癌基因家族种的一类，在正常细胞中以非激活形式存在，故又称为原癌基因。主要特点可概括如下： 　（1）在进化进程中，基因序列呈高度保守性。 　（2）它的作用是通过其表达产物蛋白质来体现的；它们的存在对正常细胞不仅无害，而且对维持正常生理功能、调控细胞生长和分化起重要作用，是细胞发育、组织再生、创伤愈合等所必需。 　（3）在某些因素（如放射线、某些化学物质等）作用下，一旦被激活，发生数量上或结构上的变化时，就会形成癌性的细胞转化基因。 ras家族 主要包括Hras,Kras,Nras 　　家族成员基因序列差异大，但所编码的蛋白质是P21，位于细胞质膜内面，P21可与GTP结合，有GTP酶活性，并参与cAMP水平的调节。 Ras蛋白的结晶结构如图所示，当GTP水解时，Ras蛋白的构象会发生改变，此改变涉及L4，它含有第61位点，致癌突变有时在此处发生。Ras的组成型激活的突变发生在L1的第12位点。它直接影响到和GTP的结合。在野生型和癌变型之间的变化限制在这些区域中，并使Ras产生一种构象来承担GTP的水解，这是癌致性的基础，关键是GTP水解能力。 图 Ras蛋白的晶体结构含有6个β链，4个α螺旋和9个连接环。GTP被L9,L7和L1所包被。从30到40的的效应区是相对暴露的，而其他的区域也有暴露的（引自Lewin,2000） （二）RAS与病毒的潜在关系 1、Activated (oncogenic) ras induces a cellular inhibitor of PKR.(Mundschau and et.）Activated ras is found in 30% of all malignant human tumors 2、The activated form of PKR is capable of blocking protein synthesis through its ability to hosphorylate the subunit of eukaryotic translation factor 2. This mechanism inhibits viral replication. 《A Genetically Engineered Influenza A Virus with ras-Dependent Oncolytic Properties》 《Ras-dependent Oncolysis with an Adenovirus VAI Mutant》 《Reovirus oncolysis: The RasRalGEFp38 pathway dictates host cell permissiveness to reovirus infection》 《Activated N-Ras Contributes to the Chemoresistance of Human Melanoma in Severe Combined Immunodeficiency (SCifi) Mice by Blocking Apoptosis‘》 二、研究目的 通过研究NRAS蛋白在细胞内的高表达是否有助于禽流感病毒的增殖，进而分析禽流感病毒与RAS蛋白之间的相互关系，并推断禽流感病毒与细胞癌症转化的相互关系。 三、研究内容 （一）突变N-RAS基因，获得N-RAS高 表达细胞系，并进行检测 （二）病毒感染的观察以及病毒输出 量测定，PKR活化的测定 （三）研究IFN与RAS的关系 （一）突变N-RAS基因，获得N-RAS高表达 细胞系，并进行检测 1、根据Genebank登陆的人NRAS序列，设计NRAS基因开放阅读框（570bp）上下游引物，从细胞内扩增NRAS开放阅读框基因，定点突变NRAS12位氨基酸密码子和61位氨基酸密码子，并连接到真核表达载体pCDNA3.1+上 （1）突变12位密码子，GGT TGT （2）突变61位密码子，CAA AAA 2、脂质体转染法将pCDNA3.1-NRAS质粒转染到VERO细胞内，使用NRAS多克隆抗体，Wes