MTT法绘制生长曲线.docVIP

MTT实验 实验材料： 1，5%FBS-L-DMEM, 5x104个/ml细胞悬液，5mg/mlMTT溶液，DMSO,0.01M PBS, 2, 96孔板共7个,酶标仪,50ml离心管，1.5ml离心管，0.22μm滤膜，锡箔纸，MTT工作液（1ml/管） 实验步骤： 分别选取生长良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液，调整细胞密度为5x104/ml。接种到96孔板，每孔接种200μl细胞悬液进行培养（每孔1x104细胞）。 培养16-48后，每天选择6个培养孔各自加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃ 孵育4h后终止培养，吸出孔内上清，此时应该倾斜96孔板，用枪头小心的将上清液吸去，不可吸去下面的结晶颗粒，慢慢吸去。每孔加入150μlDMSO,室温振荡10min，使结晶充分溶解，于试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照1孔。 注意事项： 1, 两种方法分离小型猪骨髓间充质干细胞的比较 分别取两组0,1,3代细胞，制成1x103的细胞悬液，接种到96孔板，每孔细胞悬液200微升，置37℃、5%CO2饱和湿度孵箱内孵育，各组每24小时分别取出4孔，每孔加入MTT（2mg/ml）20微升 37 来自：SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究 大鼠MSCs生长曲线测定：为了定量测定大鼠BMSCs的生长状况，对来源于同一动物的原代细胞进行连续培养。分别选取生长良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液，调整细胞密度为5x104/ml。接种到96孔板，每孔接种200μl细胞悬液进行培养（每孔1x104细胞）。次日起每天选择6个培养孔各自加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃继续孵育4h后终止培养，吸出孔内上清，每孔加入150μ 来自：2003人骨髓间充质干细胞的分离培养及部分生物学特性的实验研究 来自：2007贴壁法培养大鼠的骨髓间充质干细胞 来自：大鼠骨髓间充质干细胞移植促进皮肤创伤愈合的研究 (3)接种细胞时，尽量混匀后再接种，尽量保持每孔细胞数接近 （4）为防止96孔板的边缘效应，最好在实验组留出一空孔，内加平衡盐溶液，或者培养液以维持适当湿度，减少实验误差。 （5）加入MTT时每孔加入量很少，通常是10-15微升，不宜准确定量，可以事先算好要加入的培养液总量，以及所需MTT量，混匀后再加入培养孔内。 （6）加入MTT时，建议熄灭酒精灯，配置好的MTT应避光冷藏，一周内用完，最好在加入MTT前换一次液。 （7）在进行检测期间需要换液，换液时最好不用PBS洗，这样会损失紫色结晶，可以将96孔板拿掉铺几张滤纸在其上，小心将板翻过来，孔中液体会流出来，且不会损失，肉眼可见的结晶，加入MTT溶解液后，上下吸收可以完全溶解甲簪。 （8）为了防止板来回移动对细胞的影响，因此，把需要测得的孔，做完所有操作后吸出来，放在一个外面用的酶标板里，然后上机检测。 (9)MTT对菌很敏感，所以整个过程都要无菌。保存在-20℃ ，防止反复冻融，保存到4 （10）加入DMSO前需要去掉原培养液，但是去掉原培养液就怕会丢失结晶，因此