人类外周血染色体标本制备.ppt

* * 实验一 人类外周血染色体标本制备 一、实验目的 初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。 二、实验原理 正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，外周血细胞中是没有分裂相的。1960年发现外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 三、实验步骤 １、采血 （已完成） ２、培养（lymphocytes cell culture） （已完成） RPMI1640培养液，37℃?0.5℃恒温中培养72小时。 3、秋水仙素(colchicine)处理 在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。 （已完成） 4、离心 （centrifugalization ） 以1000rpm离心10分钟，弃上清，留沉淀 　　　并用吸管打匀。 ５、低渗处理（hypotonic treatment） 加８毫升预温(37℃)的0.075M KCl低渗液（hypotonic solution），用吸管打匀使细胞 悬浮于低渗液中，37℃水浴箱静止25－30分钟。 6、预固定（pre-fixation） 低渗后，加新配的固定剂（甲醇︰冰醋酸= 3︰1 ）１毫升，打匀。 7、再离心 1000rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀。 ８、固定 (fixation) 加入固定液（甲醇︰冰醋酸 = 3︰1）5ml，将沉淀打匀，固定20分钟。 ９、再离心 1000rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀。 10、再固定： 加入固定液（甲醇︰冰醋酸 = 1︰3），固定 20分钟。 11、再离心 1000转/分离心10分钟，弃去上清液，留沉淀。 12、再固定 加入固定液（甲醇︰冰醋酸 = 1︰1）打匀，固定 20分钟。 13、制片 固定后，1000rpm离心10分钟，留下0.2ml沉淀物，吸取细胞悬液滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在洒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（dir drying）。 　14、染色（ Giemsa staining） 　Giemsa染液染色８分钟，玻片用自来水冲洗，晾干。 　15、镜检（microscopic examination） 四、试剂和药品 1、 培养液的配制 RPMI1640培养基(含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠) 80％ 小牛血清(56℃水浴灭活30分钟) 　　　　　　　　　 20％ 植物血凝素PHA (主要成分是粘多糖和蛋白质) 　　 4％ 青霉素终浓度