产抗菌蛋白菌株的筛选和纯化及其理化性质的研究.doc

PAGE PAGE 1 微生物溶菌酶的提取纯化以及生理活性的测定 何李黎 何李黎 刘洋 指导老师： 陈卫良副教授 摘要： 本研究从面包中筛选到地衣芽孢杆菌菌株ZJU12（Bacillus licheniformis ZJU12），该菌株培养去菌液对多种革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌，以及部分植物病原真菌等具有拮抗作用。同时，该培养去菌液对水稻白叶枯病菌有溶菌作用。该菌株培养去菌液在37℃或60℃下放置1h后活力没有明显差异；在80℃和100℃处理30min后酶活力下降；在121℃下处理30min后几乎没有酶活力。 从土壤中分离得到的嗜碱芽孢杆菌ZJU11( Bacillus alcalophilus ZJU11)，对大部分革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），黄色微球菌（Micrococcus flavus）等有较强的拮抗作用，但对大部分革兰氏阴性菌和真菌无明显拮抗作用。其培养去菌液对热和蛋白酶K均不敏感，并且在pH3－11范围内无明显差异。其拮抗成分能被硫酸铵沉淀，并且能被CHCl3萃取，说明是一种脂溶性蛋白质类拮抗物质。 混合培养地衣芽孢杆菌ZJU12（Bacillus licheniformis ZJU12）和嗜碱芽孢杆菌ZJU11（Bacillus alcalophilus ZJU11）所得的培养去菌液对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的拮抗作用（抑菌圈直径）比ZJU12和ZJU11单独培养后所得的培养去菌液对金黄色葡萄球菌的拮抗作用（抑菌圈直径）大，最大的相对效价能提高98.6％。将ZJU12菌株的培养去菌液和ZJU11菌株的培养去菌液混合，同样对金黄色葡萄球菌具有协同增效作用，最大的相对效价能提高56.2％。将纯化后ZJU12菌株的拮抗物质和ZJU11菌株的培养去菌液混合，仍能测得协同作用，虽然协同作用比前两种方法测得的小，最大的相对效价能提高36.1％，说明ZJU12培养去菌液中可能还有其他物质参与协同作用。另外，利用实验中获得一株金黄色葡萄球菌的变异菌株作为指示菌，ZJU12菌株和ZJU11菌株所得的培养去菌液对于其均无拮抗作用， 但将ZJU12菌株的培养去菌液或ZJU12菌株的纯化拮抗物质后和ZJU11菌株的培养去菌液混合后，发现其混合液对该变异金黄色葡萄球菌具有明显的拮抗作用。 关键词：地衣芽孢杆菌，拮抗蛋白，理化性质，纯化, 嗜碱芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，协同增效作用 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）产生的肽类拮抗物质最早为Johnson『1』等人于1945年从Bacillus subtilis var Tracy(1994年Meleney改名为Bacillus licheniformis var Tracy)菌株中分离到的一种环状多肽类拮抗物质，命名为杆菌肽（Bacitracin），分子量约为1.4Kda,在生物体内它不在核糖体内合成（非基因编码），而是通过内硫代模板机制合成，具有对蛋白质水解酶的抗性，其水溶液在弱酸性（pH5－7）较稳定，在pH9.0以上易失活，对热敏感『2』，并且杆菌肽的抑菌活性需要依赖二价的金属离子，如Zn(II)，Co(II), Ni(II), and Cu(II)等。其中以锌对其活性的增强作用最大『3』。至今以发现了9种杆菌肽成分，其中以Bacitracin A活性最高。其作用机制为： ①杆菌肽是类脂质焦磷酸的特异性抑制剂，能抑制细菌细胞壁合成的脱磷酸化过程，影响磷脂载体的运转及向细胞壁支架输送粘肽，从而抑制细胞壁的合成； ②与敏感菌的细胞膜相结合，损伤细胞膜，使细胞膜通透性增加，导致膜内物质外流； ③干扰敏感菌细胞内原浆蛋白的合成。 杆菌肽是一种强杀菌剂，其抗菌谱与青霉素相似，能强烈抑制革兰氏阳性菌，特别是梭状芽孢杆菌、葡萄球菌、链球菌、棒状杆菌等病原菌对之极为敏感，对耐青霉素的金黄色葡萄球菌也有较强的抑制作用；同时对部分革兰氏阴性菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌以及放线菌、螺旋体也有一定的抑制作用。 发现杆菌肽之后，人们又陆续发现了一些地衣芽孢杆菌产生新型的拮抗物质。总结如下： 1． 小肽类抗菌物质（分子量大约在1.4-3.5KDa之间） Galvez『4』等于1993年从一株地衣芽孢杆菌A12中分离到两种阿米巴素（amoebicinsA12－A 和A12－B）。这两种物质对热和蛋白质酶均不敏感，分子量为 1，430。对福氏耐格里阿米巴（Naegleria fowleri）具有溶解作用，并且对酵母(Saccharomyces heterogenicus 和Cryptococcus neoformans)，部分真菌(Aspergillus niger,