慢病毒载体的构建方法.pptVIP

Introduction 慢病毒（Lentiviruses）属于逆转录病毒科。慢病毒核蛋白质前整合复合物具有噬核特性，病毒基因组运输至细胞核，从而使慢病毒可以感染和在非有丝分裂细胞中复制。这一特性使慢病毒成为基因治疗的转移载体。 HIV （Human immunodeficiency virus） 、EIAV （Equine infectious anemia virus） 、 FIV （Feline immunodeficiency virus） 、 SIV （Simian immunodeficiency virus） 。其中研究最多最为透彻的是HIV。 Lentiviruses life cycle 慢病毒通过病毒衣壳糖蛋白与细胞膜上的特异受体结合而进入易感靶细胞。一旦与细胞膜上的特异受体结合，慢病毒膜和细胞膜融合后病毒核心释放入细胞浆里。病毒RNA逆转录合成双链线性DNA而转运之细胞核。线性病毒DNA永久性的整合入染色体DNA（宿主基因组）中，形成前病毒，成为永久的遗传成分，在细胞周期中与靶细胞基因一样进行复制，转给子代细胞。前病毒DNA转录成RNA后再转运至胞浆，在胞浆里RNA翻译成病毒蛋白。病毒前结构蛋白和复制酶与病毒RNA组装成新的病毒核心，从包装细胞获得病毒包膜蛋白后以出芽的方式从细胞膜上释放出。病毒前结构蛋白经进一步处理而最终形成成熟的具有感染性的子代病毒颗粒。这些特性是慢病毒成为基因治疗转运工具的重要原因 。 Lentiviral Vector SystemsUnder Development Primate Human immunodeficiency virus (HIV) Simian immunodeficiency virus (SIV) Non-primate Feline immunodeficiency virus (FIV) Equine infectious anemia virus (EIAV) The outline of this ppt 接下来将以 HIV为例从以下方面说明慢病毒载体构建方面的基础知识： 一. HIV-1 life cycle 二. HIV-1基因结构和病毒颗粒结构 三.载体系统构建的基本原理 四.载体系统的设计 五.包装系统的设计 ----- HIV-1-Derived lentiviral vector production , concentration titration 1. HIV-1-Derived lentiviral vector production titration 2.HIV-1 Vector Production----Supernatant recoveries concentrat 六.The difference of Packaging Cells for LVV with other retroviruses 七.The Development of LV Vectors 八.Advantages and Disadvantages of Lentiviral vectors 九.The comparison of Lentiviral vectors with other vectors 一 HIV-1 life cycle 二 HIV-1基因结构 gag, -----群抗原基因，编码核心蛋白p24 pol -----多聚酶基因，编码多聚酶； env-----包膜蛋白基因，编码包膜蛋白gp120 及gp41； tat ----- 基因反式激活因子对HIV-1基因其正调控作用 rev,----- 病毒蛋白表达调节因子，能增加gag和env基因对结构蛋白的表达 vif,----- 病毒感染因子, 其作用是在一些细胞因子的协下促进HIV-1在细胞内复 Vpr,----- R蛋白能使HIV在巨噬细胞中增殖 vpu,----- U蛋白，能促进HIV从细胞膜上释放 nef,----负因子，具有抑制HIV-1增殖作用 二 HIV-1病毒颗粒结构 三 载体系统构建的基本原理 HIV-1基因组中如包装信号、长末端重复序列的顺式作用元件与编码反式作用蛋白的序列进行分离。即从病毒基因组中将反式gag, pol, and env基因(其他辅助基因省去)从病毒中分离出而用我们感兴趣的外源性目的基因代替，剩下的顺式作用元件在病毒复制周期中------逆转录、整合、转录和包被--------可以被其它病毒或细胞蛋白识别。 四