核酸适体技术.pptVIP

研究核酸与蛋白质的相互作用的方法 ----核酸适体技术 核酸适体(aptamer)指的是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段,对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适体在生物传感器、新药开发以及纳米技术等方面有着广泛的用途。 利用现有的分子生物学技术人工合成一个含有1014～1015个单链寡核苷酸序列的随机文库,序列长度一般在25～35个核苷酸之间,这一步起到达尔文进化论中自发突变的作用。 单链的随机寡核苷酸序列,容易形成可与蛋白质、核酸等配体特异性共价结合的二级结构。在这一高亲和力特异性结合的基础之上,配体如氨基酸、多肽、甚至金属离子都可以同随机文库相互作用,这种特异性结合类似于达尔文进化论中的自然选择作用。 选择性分离出核酸适体后,通过PCR或RT-PCR等技术进行扩增,生成次一级文库,这种扩增达到了达尔文进化论中的大量增殖的效果。 适体与配体的相互作用 核酸适体上富含嘌呤的环常作为外来靶序列的结合位点,常为嘌呤-嘌呤排列(包括碱基错配、碱基三聚体和碱基平台) 大多数核酸适体上都可观察到G-A错配或G-G错配。这些错配在环与正常的双螺旋碱基对之间的堆积处产生一个转折点,通常导致环的关闭。 核酸适体与配体结合时,通常会通过构型适配形成一些稳定的二级结构,如发卡(hairpin)、茎-环(stem-loop )、G-四聚体( G-tetramer )、假节(pseudoknot )。 与同一种配体结合的核酸适体往往可分为几个亚群,而针对同一表位的核酸适体的重要功能区有相同的结构域(motif)。核酸适体与配体的相互作用力包括如下几种类型:“假碱基对”的堆积作用、氢键作用、静电作用和形状匹配等。 核酸适体应用进展 生物传感器 生物传感器在快速检验中发挥着重要作用,它将分子识别与信号传导器相结合。应用抗体的免疫传感器已获得很大进步,但固化在传感器表面的抗体易衰减而失败,利用适体制成的适体传感器具有以下优点:(1)固化的核酸可反复变性与复性即使在热、盐浓度、络合剂使用下也可反复变性;(2)适体容易以一定厚度连结在固相表面;(3)适体发生信号物广泛,可以用荧光、酶、生物素、亲和素等。 药物设计和临床治疗 由于核酸适体与蛋白特异性结合后往往能抑制蛋白的功能,而且它缺乏免疫原性,体内渗透力强,因此是一种很有发展前途的药物分子,可用于直接干扰疾病的发生发展过程。迄今筛选到的HIV、HCV、多种肿瘤及肿瘤相关因子、凝血酶、弹性蛋白酶、茶碱、氨基糖类抗生素的适体已在治疗中展示了良好的应用前景。 适体技术与纳米技术的结合 如分子信标，它是在长度为15～30mer寡核苷酸探针的两端分别加上5～8mer序列互补的茎杆区。在自由状态时由于茎杆区互补序列的结合使探针分子形成发夹状结构。探针的5 -端及3 -端分别联用荧光素分子及猝灭剂分子。自由状态时,发夹结构的两个末端靠近,使荧光分子与猝灭分子靠近(约为7～10nm)。 此时发生荧光共振能量转移,使荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发,荧光几乎完全被猝灭。当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时,信标茎杆互补区被拉开,荧光分子和猝灭分子距离增大。杂交后,信标分子的荧光几乎100%恢复。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。 核酸适体出现以后,由于其高特异性与高亲和性的特性,使得核酸适体立即在纳米技术领域引起了科学家们的注意,应用适体的分子信标名为“适体信标”(Aptamer beacon)。适体信标更加稳定灵敏核酸适体，将在发展各种可以取代抗体的蛋白质探针、测定体内蛋白质和研究其功能、疾病早期诊断等方面具有极大的应用潜力。 THANK YOU! * SELEX技术 SELEX是指数富集配体系统进化(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment)的简称,其筛选流程包含和达尔文进化理论一样的三个过程,分别是自发突变、自然选择和大量增殖。 一“自发突变” 二“自然选择” 三“大量增殖” *