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生物工程专业实验讲义 (适用于生物工程专业) 曹飞 制药与生命科学学院 二零零九年四月 目 录 实验一 发酵种子的制备…………………………1 实验二 E.coli和 Pseudomonas dacunhae 2014发酵培养………2 实验三 高速冷冻离心机的使用方法……………….3 实验四 固定化生物催化剂的制备…………………4 实验五 游离细胞与固定化细胞酶活比较…………………5 实验六 固定化生物催化剂的连续生产………………6 实验七　Ｌ－Asp的分离…………………………………7 实验八 Ｌ－Asp脱羧反应制备L-Ala……………………6 实验九 离子交换树脂分离L-Ala…………………8 一、实验原理与实验流程 实验原理： 实验流程： 清洗发酵罐 清洗发酵罐 培养基配制 灭菌 接种 微生物发酵 离心 湿菌体 卡拉胶 固定化细胞 富马酸溶液配制 转化 脱色 等电点结晶 过程检测（菌体浓度、形态、pH） 固定化细胞与游离细胞酶活测定 标准曲线绘制 干燥 L－天冬氨酸 培养基配制 灭菌 接种 微生物发酵 转化 离心 脱色 离交分离L-丙氨酸 浓缩 重结晶 L－丙氨酸 PS20147 纸层析检测反应进程 过程检测（菌体浓度、形态、pH） 离子交换树脂预处理 实验一 发酵种子的制备 目的要求 了解实验室种子制备过程。 原理 种子制备过程包括琼脂斜面、固体培养基扩大培养、摇瓶液体培养和种子罐培养等多级扩大培养。在实验室里，一般只进行到摇瓶液体培养获得发酵用种子。不同菌种其具体制备方法不同，下图是菌种子制备过程示意图。 斜面 斜面 沙土管 冷干管 液氮管 实验室种子制备 生产现场种子制备 生产种子制备的一般流程 菌种保藏 二级斜面 一级斜面 米孢子 母瓶 子瓶 一级种子罐 发酵罐 二级种子罐 三级种子罐 试验及器材 菌种：斜面低温保藏的大肠杆菌（E.coli）和Pseudomonas dacunhae 20147 培养基：E.coli种子培养基：牛肉膏 0.5% 、NaCl 0.5%、 蛋白胨 1%、 pH 7.6~7.8 P.dacunhae 20147种子培养基：15g/L谷氨酸钠、蛋白胨8g/L 、玉米浆5.5 g/L , KH2PO4 0.5g/L ,MgSO4 0.1g/L 器材：天平、灭菌锅、试管、三角瓶（500mL） 操作方法 按种子培养基配方分别配制1000mL液体培养基，分装于三角瓶中，每瓶100mL，压力1Kg/cm2灭菌30mins，结束后取出。 挑一环斜面低温保藏的E.coli和 P.dacunhae 20147接于各自的种子培养基中，37℃培养24hs，转速约150rpm 种子瓶摇好后，及时接种到发酵罐。也可以在冰箱中短时间保藏。 思考与讨论 实验室种子制备的原则是什么？ 哪些参数对于实验室种子制备产生影响？ 实验二 E.coli和 Pseudomonas dacunhae 2014发酵培养 目的要求 了解发酵罐的结构，掌握发酵罐的基本操作技术。 了解发酵罐中微生物生长的生长特征。 掌握实验室中微生物从斜面→摇瓶→发酵罐的无菌操作培养技术，对工业化微生物生产过程作出初步了解。 掌握酶合成代谢调控机制。 掌握发酵工艺控制工艺。 原理 一定数量的微生物，接种于合适的新鲜培养基中，在适宜的培养条件下，所表现出的群体生长特征可分为四个时期，即延迟期、对数期、稳定期和衰亡期。微生物在各个时期的生理特征各不相同。 微生物的生长过程是其总的代谢活动的综合体现，每一种代谢途径均由一些特有的酶的反应组成，同时微生物代谢具有高度的调节作用，通过本实验了解酶合成的调节机制之一―――酶合成的诱导。 试剂及器材 菌种：实验一液体培养24h的E.coli和 P.dacunhae 20147的实验室种子 发酵培养基： E.coli发酵培养基: 玉米浆4%、富马酸1%、K2HPO40.5%、MgSO40.25%、NaCl0.1%（用氨水溶解富马酸后再加入玉米浆和其他成分，用稀盐酸调节pH为7.5），消泡剂1-2mL，pH 7.5。 P.dacunhae 20147发酵培养基：20g/L谷氨酸钠、蛋白胨10 g/L 、玉米浆20 g/L , KH2PO4 0.5g/L ,MgSO4 0.1 g/L、消泡剂1-2mL，用氨水调pH 至7.0 121℃，灭菌20min。通气，冷却至37℃（E.coli）或30℃（ 4．器材：发酵罐、灭菌锅、721分光光度计、超净工作台、台式高速离心机、离心管、移液管。 四、操作方法 按配方先后配制1000mL发酵培养基，调pH7.5，装入发酵罐中，包扎好各个进气口、出气口和取样口，保持121℃下灭菌30m