蛋白质纯度检查2.ppt

（一 ）原材料的控制 1．表达载体和宿主细胞 应提供有关表达载体详细资料，包括基因的来源、克隆和鉴定，表达载体的构建、结构和遗传特性。 应说明载体组成各部分的来源和功能，如复制子和启动子来源，或抗生素抗性标志物。提供至少包括构建中所用位点的酶切图谱。 应提供宿主细胞的资料，包括细胞株（系）名称、来源、传代历史、检定结果及基本生物学特性等。 应详细说明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态（是否整合到染色体内）及拷贝数。应提供宿主和载体结合后的遗传稳定性资料。 2．克隆基因的序列 应提供插入基因和表达载体两侧端控制区的核苷酸序列。所有与表达有关的序列均应详细叙述。 3．表达 应详细叙述在生产过程中，启动和控制克隆基因在宿主细胞中的表达所采用的方法及表达水平。 4．原辅料 原辅料应按照国家药品监督管理局有关规定执行。动物源性原料的使用应提供来源及质控检测资料；发酵用培养基不能添加β内酰胺类抗生素。 （二）生产的控制 1．主细胞库（MASTERCELLBANK） 2．有限代次生产 3．连续培养生产 4．纯化 （三）最终产品的控制 1．物理化学鉴定 （1）氨基酸组成 （2）氨基酸末端序列 N-端和C-端氨基酸 （3）肽谱 （4）巯基和二硫键 巯基和/或二硫键的数量和位置。 （5）碳水化合物结构 中性糖、氨基糖、唾液酸 （6）分子量 应用分子筛层析法、SDS（还原和/或非还原条件下）、质谱测定法。 （7）等电点 通过等电聚焦电泳或其他适当的方法测定。 （8）消光系数（或克分子吸光度） （9）电泳图型 （10）液相层析图谱 分子筛层析、反相液相层析、离子交换液相层析、亲和层析获得目的产品/药物的一致性、同一性和纯度的层析图谱和数据。 （11）光谱分析 2．杂质检查 （1）工艺相关杂质 工艺相关杂质来源于生产工艺，可分三大类：来源于细胞基质、培养基和下游工艺。 ①来源于细胞基质的杂质包括源于宿主生物体的蛋白/多肽；核酸（宿主细胞/载体/总DNA）；多糖及病毒。 ②来源于培养基的杂质包括诱导剂（多核苷酸,病毒）、抗生素、血清及其他培养基组分。 ③来源于下游工艺产生的杂质包括酶、化学/生化处理试剂（如溴化氰、胍、氧化剂和还原剂）、无机盐（如重金属、砷、非有色金属离子）、溶剂、载体/配体（如单克隆抗体），及其他可滤过的物质。 （2）产品相关杂质 ①化学修饰类型：应考虑脱酰胺、异构化、错配S-S连接和氧化形式的分离和鉴别。 ②降解物和聚合体：聚合体包括二聚体和多聚体：可用分子筛层析法（如SE-HPLC）进行定量；降解物：应建立降解物的判定标准，并对稳定性试验产生的降解产物进行监测。 3．生物学测定 （1）鉴别试验 应用免疫印迹法 （2）效价测定 采用国际或国家参考品，以体内或体外法测定制品的生物学活性，并标明其活性单位。 （3）特异比活性测定 测定其特异比活性，以活性单位／重量表示。 （4）热原质试验 （5）无菌试验 （6）抗原性物质检查 抗原可能产生的抗体或变态反应。 （7）异常毒性试验 重组人干扰素α-2b注射液质量标准 拼音名：Chongzu Ren Ganraosu α2b Zhusheye 英文名：Recombinant Human Interferon α2b Injection 本品系由含有高效表达人干扰素α2b基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。 1 基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2．1 工程菌菌种 2．1．1 名称及来源 重组人干扰素α2b工程菌株系由带有人干扰素α2b基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。 2．1．2 种子批的建立 2．1．3 菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。 2．1．3．1 划种LB琼脂平板 应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。 2．1．3．2 染