八章园艺植物生物技术4p分pt课件.pptVIP

一、mRNA差异显示技术 2. 基本步骤 从不同植物或组中提取总mRNA. 用oligo(dT)12MN为引物(其中,M=G/C/A,N=G/C/T/A),在反转录酶的作用下,将mRNA反转录成 cDNA. 用与反转录相同的锚定引物和由10个碱基组成的随机引物对生成的cDNA进行PCR扩增. PCR扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在相邻泳道上分析,找到差异表达的cDNA条带. 加收差异表达的条带,将其作为探针进行Northern杂交或筛选cDNA文库,获得差异表达的基因全长. 一、mRNA差异显示技术 3. 优缺点 优点 在基因序列未知的情况下，直接用来鉴定和克隆差异表达基因，具有简便，快速，RNA用量少，效率高等优点。 主要用于比较两种以上特定生理状态或不同发育阶段的mRNA样品间基因表达的差异. 缺点 假阳性特别高，可达70%，增加了后续工作的难度。 由于PCR的敏感性，mRNA差异显示技术重复性较差. 扩增片段较小(110-500bp),不能代表差异表达的基因. 只能扩增靠近Poly(A)mRNA3端不大于600bp的区域。 对高拷贝mRNA有较强的倾向性，不能用于低拷贝的mRNA. 二、抑制性消减杂交技术 1. 原理 以抑制PCR为基础的cDNA消减杂交. 所谓抑制PCR是利用非目标基因片段两端的长方向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对，选择性