第6章--分子生物学技术.pptVIP

2、引物（Primers) 引物是化学合成的寡核苷酸片段，它决定了PCR扩增产物的特异性和长度。 化学合成的寡核苷酸 能与模板特异地结合 引物决定产物的特异性和长度 引物设计时必须遵循一些原则 设计引物的原则 二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补。 长度为18 - 25个核苷酸。 二条引物之间避免形成引物二聚体。 引物的碱基组成应平衡。 引物的5’端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记） 引物浓度：0.1 ~ 0.2 umol/L,浓度过高容易生成引物二聚体。 3、脱氧核苷三磷酸（dNTP） 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致。 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异 性扩增也随之增加 。 dNTP浓度：20 ~ 200 umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。 4、DNA聚合酶 从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的热稳定性。 Taq 酶的作用: 在模板指导下，以dNTP为原料，于引物3’-OH末端处加上脱氧单核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。 最适酶量：1-2.5U 。酶量过多，导致非特异性扩增。 5、镁离子浓度 镁离子浓度对于Taq 酶的活性有直接影响。 PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的均可与Mg2+结合，降低游离Mg2+的浓度，从而影响酶的活性。 当dNTP浓度为200umol/L，MgCl2的浓度为1.5mmol/L时较适宜。 （二）PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸） 循环次数（PCR效率及产物量） 1、温度 变性温度：94 ~ 97 ℃ 退火温度：低于引物Tm 5 ℃左右 温度过高--降低扩增效率； 温度过低--增加非特异性扩增 延伸温度：72℃，此时Taq酶具有较高的酶促活性 2、时间 第一次变性应给予足够时间（5 ~ 7分钟） 每个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒~ 1分钟，时间过长易导致非特异性扩增。 3、循环次数 重复次数一般设为25~35个循环 扩增反应的平台效应： 理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。 三、PCR中试剂与样本的保存 1、裂解液 4℃贮存，避免反复冻融，否则影响裂解效果，造成假阴性。2、反应液 -20℃贮存。试剂开封后，4℃保存在1~2周内用完。反应液反复冻融5次影响不大，但过多的冻融会降低扩增效率。 （一）试剂贮存 3、Taq酶 -20℃贮存（存于有霜冰箱）。4、阳性模板 -20℃贮存，可反复冻融5次左右。阳性模板4℃也可贮存2周左右。 1、尿道、阴道、宫颈分泌物 棉拭子经生理盐水洗涤后，2000r/min后取上清500ul。过多的沉淀物裂解后，会导致PCR抑制而产生假阴性结果，或出现电泳背景模糊和拖尾现象。尤其是脓性分泌物，沉淀物过多，易造成假阴性。 （二）标本处理 2、尿液 男性尿道炎患者，若无分泌物，可用初段尿。尿液置冷冻保存，但解冻后需37℃保温，以使尿盐充分溶解，过多的盐沉积物会抑制PCR。 3、血清 乙型肝炎病毒，血清可置4℃贮存几天，-20℃贮存三个月以上不影响检测结果，经多次冻融也不影响检测结果。 丙型肝炎病毒等，血清必须置-20℃贮存，一般冻融3次以上便会影响检测结果，导致假阴性。 4、全血 尽快处理（一般不超过24h），因为白细胞会随时间的延长而减少。处理时尽量将红细胞去除干净。红细胞末去除干净，将干扰PCR，导致扩增效率下降。 5、痰液 先用1N NaOH液化，37℃~50℃可缩短液化时间，长时间的液化（过夜或数天）不影响结核菌的检测。 痰液消化后，均要用蒸馏水洗涤离心沉淀物1-2次，否则，沉淀物过碱而抑制PCR。 6、胸水、脑脊液 胸水、脑脊液标本离心所得沉淀物极少，加裂解液的量也要相应减少。为保证裂解充分，可在管内滴入1-2滴石蜡油后再裂解。 （三）样本保存 送检标本不能及时处理，除全血外，均可置-20℃保存数天。 处理好的标本可置-20℃保存。检测时需将解冻后的标本充分振荡，经100℃水浴5min，离心后取上清液检测。 以PCR为基础的相关技术 逆转录PCR (reverse transcription PCR,