基因工程工程菌构建.pptVIP

1，3-丙二醇新型基因工程菌的构建 ; 1，3．丙二醇是目前国际上公认的六大石化新产品之一，其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1，3一丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物转化法，但从自然界中筛选的微生物厌氧发酵甘油生产l，3一丙二醇还存在产物生产周期长和转化率低等问题，目前仅有化学合成法应用于工业生产。因此，利用基因工程技术构建高产菌株备被认为是今后的发展方向。;1，3-丙二醇性质;1，3-丙二醇用途;1，3-丙二醇基因工程菌构建的预期目标;1，3-丙二醇??因工程菌构建的路线; 1，3．丙二醇生物合成途径 l，3一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物,并未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来。甘油作为唯一碳源和能源，它可以沿着氧化和还原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类发酵产物一致，并产牛供细胞牛长所必需的ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1，3一丙二醇 。 ;一、大肠杆菌JMl09的构建及其表达; ;;6000 r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液。 （7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中，静置1 min后，6000r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于6000 r／min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。 (8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1．5 mLEppendorf离心管中，加入适量洗脱缓冲液，常规50此，室温放置2．5min后，6000 r／min离心2min。 (9)取5“L酶切后电泳鉴定。 ;(二)、大肠杆菌感受态细胞的制备 (1)接种EcoliJM109于LB培养基中振荡培养过夜。 (2)取0．5mL培养液于50mLLB培养基中37℃振荡培养至OD值O．3—0．4。 (3)菌液三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃，使菌液迅速冷却约10分钟。 (4)分装菌液到Eppendorf管(1．5mL)中，Eppendorf管迅速放入冰水中静置15min。 (5)8000r／min离心5min，然后静置2min，冰水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl2400uL， ; ;（三）、转化大肠杆菌;（四）、大肠杆菌JMl09基因工程菌的构建;（五）、酶活力测定 ;（六）、1，3．丙二醇含量的测定;二、重组质粒pUC—tac-dhaT的构建及其与pEtac—dhaB—tac-yqhD在大肠杆菌JMl09中共表达;实验材料 菌种：E coliJMl09(pEtac-dhaB—tac-yqhD)为本研究“第二章构建保存的；质粒pUCl9， pEtac由本实验室保藏：dhaT基因从克雷伯氏菌中 试剂和工具酶：质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒 工具酶、抗生素 公司、华美生物 ；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、 3PCR引物 根据克雷伯氏菌公布的序列， 。 ; 引物： 3PCR引物 根据克雷伯氏菌公布的序列，设计片段pEtac．dhaTPCR所需引物：Ps：5’-ACCGCAATTGATGAGCTATCGTATGTTTG一3’： P6：5-ACC CAGAATGCCTGGCG．3’。引物两端均弓l,KmfeI、HindlII酶切位点。;实验条件和方法 PCR反应体系及反应条件：PCR反应体系：在0 5 mL Eppendorf管中按顺序加入以下试剂：10×buffer 5 m，2 5mmol／LdNTP4lLl，MgCl24IlI，上下游引物各1 IIl，模板DNA2 pl，脚酶1 itl，ddH20 32m，总体积50 pl。 1．3一丙二醇氧化还原酶dhaT的反应条件： 94℃预变性5min：变性90 s，54℃退火l 5min，72℃延伸l 5rain，循环35次；72℃保温10min。 ; （1）大肠杆菌基因工程菌的构建 将来源于克雷伯氏菌的基因片段dhaT连入载体pEtae，以得到的重组质粒pEtac-dhaT。经酶切得到片段tac-dhaT连接到pUCl9上，以得到的重组质粒pUC-tac-dhaT。将基因工程菌pUC-tae-dhaT和基因工程pEtac-dhaB-tac-yqhD共转化大肠杆菌KcoliJMl09。 （2） 1，3．丙二醇氧化还原酶的酶活力测定 测定1，3-丙二醇氧化还原酶的酶活。酶活测定根据250C条件下NAD+还原成NADH的速率来定量。酶活单位定义为1国际单位(1u)等于每分种还原1lJmol底物NAD+或生成1“raol产物NADH的酶量。;四、重组菌coliJMl09(pEtac—dhaB—tac-yqhD， pUC—tac—